Imagerie de la migration en direct des cellules gliales dans le disque Eye drosophile Imaginal

Nous disséquons les larves en saisissant les extrémités postérieure et antérieure, puis en tirant les pinces dans des directions opposées. Les tissus excédentaires sont éliminés à l’aide de ciseaux ultrafins. Cela mettra en évidence les deux hémisphères des disques imaginaux cérébraux et oculaires de la larve.

Le cordon nerveux ventral et les crochets buccaux. Le complexe œil-cerveau larvaire est transféré dans une chambre de culture. Nous séparons le lobe cérébral du pédoncule optique afin de visualiser la migration des cellules gliales au sein d'un disque imaginal oculaire de type sauvage.

Pour observer les cellules gliales arrêtées dans la tige optique d'un mutant, nous laissons le lobe cérébral attaché à la tige optique. Je m'appelle Patrick Cafferty du laboratoire de Vanessa Als du Département de zoologie de l'Université de la Colombie-Britannique. Salut, je suis Rin.

Elle aussi, aujourd'hui, nous allons vous montrer une procédure permettant de visualiser les cellules gliales migratrices dans l'œil en développement de drosophile. Nous utilisons cette procédure dans notre laboratoire pour étudier le développement des cellules gliales. Commençons donc.

Une semaine avant le début de l'expérience, les mouches sont accouplées afin de produire des larves exprimant la GFP sous le contrôle d'un promoteur spécifique aux cellules gliales. Cette expérience consiste à visualiser la GFP marquée par une séquence de localisation nucléaire, exprimée dans les cellules gliales. À l'aide du promoteur à polarité inversée, préparez des lamelles rondes de 18 millimètres au moins un jour à l'avance en les faisant tremper pendant 10 minutes dans une solution de poly-L-lysine à 1 %, puis laissez-les sécher à l'air libre toute la nuit précédant l'expérience.

Nettoyez une chambre de culture magnétique à chaîne en trempant ses composants toute la nuit dans de l'éthanol à 70 % le jour de l'expérience. Utilisez des techniques aseptiques pour préparer le milieu de culture. Ajoutez du sérum de veau fœtal, une solution de pénicilline et de streptomycine, et de l'insuline à 10 millilitres de milieu insecte de Schneider.

Laisser sécher à l'air la chambre de culture magnétique propre dans une hotte de culture cellulaire avant de rincer l'éthanol résiduel avec le milieu de culture préparé. Une fois ces préparations effectuées, nous pouvons commencer la dissection du complexe œil-cerveau de drosophile. Pour commencer cette procédure, sélectionner une larve de drosophile en troisième stade larvaire errante sur la paroi d'un flacon à mouches et la placer dans une goutte de milieu de culture refroidi sur une boîte de Pétri posée sur de la glace pendant plusieurs minutes afin de la refroidir.

On recommande de ralentir les contractions péristaltiques du corps des larves pour faciliter la dissection. Ensuite, placer la larve refroidie dans une goutte de milieu de culture sur une boîte recouverte de gélose, sous un microscope stéréo ; à l’aide d’une pince fine Dumont, saisir fermement la larve. À environ un tiers de la distance depuis l’extrémité postérieure, attendre que la larve sorte ses crochets buccaux par l’extrémité antérieure et, lorsque les crochets buccaux sont complètement étendus, les saisir avec une deuxième paire de pinces.

Pour disséquer les larves, écartez lentement les deux paires de pinces en les tirant dans des directions opposées. Le complexe œil-cerveau, ainsi que les glandes salivaires, les corps gras et les tissus imaginaires, se détacheront du corps de la larve. N'arrachez pas trop rapidement les crochets buccaux, sinon ils se détacheront du complexe cerveau-larvaire (iBrain).

Retirez les glandes salivaires, les corps gras et les disques imaginaires. À l’aide de ciseaux fins, les deux hémisphères du cerveau et les disques oculaires resteront attachés au cordon nerveux ventral et aux crochets buccaux. Ensuite, placez une lame couvre-objet de 18 millimètres sur une lame porte-objet, en laissant un bord de la lame couvre-objet dépasser du bord de la lame. Pour pouvoir ramasser la lame couvre-objet ultérieurement, ajoutez une goutte de milieu de culture sur la lame couvre-objet.

Saisir les crochets buccaux avec une pince et transférer le complexe iCerveau dans le milieu de culture sur le lamelle. Une fois le complexe œil-cerveau transféré sur le lamelle, utiliser une dissection fine. Ciseaux pour sectionner les crochets buccaux du complexe œil-cerveau.

Le retrait des crochets buccaux est important pour l'imagerie vivante, car les crochets buccaux continuent de se contracter dans le milieu de culture, ce qui provoque un déplacement du tissu pendant la microscopie. Pour visualiser le GL dans la tige optique, laissez la tige optique cérébrale et le disque imaginal de l'œil intacts. Pour visualiser la migration des cellules gliales dans le disque imaginal de l'œil, coupez soigneusement la tige optique, le tissu fin reliant le cerveau et le disque oculaire, puis éloignez ou jetez le cerveau.

Enfin, prenez la lame couvre-objet à l’aide de pinces et tracez un cercle sous celle-ci autour du tissu d’intérêt avec un marqueur indélébile. Ce cercle facilitera la localisation du tissu en microscopie ultérieurement. À présent, le disque imaginal de l’œil est prêt à être monté dans une chambre de culture magnétique.

Pour monter le disque imaginal de l'œil dans une chambre de culture magnétique, utilisez une pince pour saisir le bord en surplomb du coverslip et transférez le coverslip sur la plaque inférieure de la chambre magnétique à chaîne sans perturber le tissu en culture. Ensuite, placez l'anneau torique en silicone sur le corps principal de la chambre à chaîne. Installez lentement le corps principal au-dessus de la plaque inférieure.

Ajoutez le milieu de culture dans la chambre. N'ajoutez pas le milieu de culture trop rapidement, sinon le tissu sera perturbé, ce qui permettrait des échanges gazeux sous le couvercle. Ne remplissez pas complètement la chambre ; placez délicatement le couvercle invisible au-dessus de la chambre délimitée par la ligne en pointillés.

Pour visualiser les cellules gliales en migration, placez la chambre de culture sur la platine d'un microscope confocal ou à fluorescence. Localisez l'échantillon en utilisant le cercle sur le couvre-objet comme repère, en faible grossissement. Focalisez sur l'échantillon à l'aide d'un objectif ×40.

Laisser le tissu se déposer et capturer des images du disque oculaire ou du pédoncule optique toutes les 10 à 15 minutes pendant trois à quatre heures, si la procédure est correctement réalisée. Ce protocole permettra d'obtenir une série d'images de cellules gliales marquées avec GFP qui migrent du pédoncule optique vers le disque imaginal oculaire. Alors qu'une imagerie en temps réel pendant 60 minutes s'est révélée suffisante pour observer des changements dans la position des noyaux gliaux avec un disque imaginal oculaire de type sauvage, les noyaux gliaux d'un mutant pour un gène nécessaire à la migration des cellules gliales n'ont absolument pas réussi à quitter le pédoncule optique.

Nous avons cultivé des complexes œil-cerveau pendant des périodes allant jusqu'à 240 minutes avant d'observer une détérioration du tissu cultivé. Après le point temporel de 240 minutes, nous commençons à observer des cellules positives pour la GFP dans le milieu de culture entourant les complexes œil-cerveau. De plus, la GFP s'accumulera en taches diffuses à travers les tissus, suggérant une altération de l'intégrité tissulaire.

Nous venons de vous montrer comment cultiver des disques imaginaux afin d'étudier la migration des cellules gliales. Merci d'avoir regardé et bonne chance dans vos expériences.