Transfert nucléaire dans des ovocytes de la souris
30 novembre 2006
Ce film et le protocole sont destinées à aider l'apprentissage du transfert nucléaire.
Nous effectuons donc un transfert nucléaire NU car notre équipe s'intéresse au reprogrammation. Ce processus fascinant permet de reprogrammer un noyau différencié à l'état embryonnaire. Voici les cas de réactifs SUM et HCCV, et ceci est l'hyaluronidase.
Et tout d'abord, je prépare une boîte avec, et celle-ci ira dans les incubateurs pour équilibrer avec un CO2. Ce sont des gouttes, plusieurs gouttes pour Turing recouvertes d'huile minérale. Ainsi, elles calibrent l'atmosphère de CO2.
Préparez maintenant une goutte de HCZB. Elle servira au lavage. Cette dernière est placée sur des jours et à nouveau recouverte d'huile minérale.
Ce niveau élevé diminue avec l'hyaluronidase. Cette partie ici correspond simplement à des gouttes de HCCP. Elles servent au lavage.
Ceci sert à retirer les cellules ulu du côté O. Cette étape est chauffée afin qu'elle se réchauffe pendant que je reviens chercher les signes huileux provenant des souris et que j'applique une couche d'huile minérale sur l'ensemble. Ce sont ici des gouttes de PVP utilisées pour nettoyer l'aiguille et y déposer les cellules, et ceci est du HCCB plus Cyla B. C'est ici que j'effectuerai les manipulations.
Voici une couleur d'aiguille. Ce que je fais maintenant, c'est que je sors une aiguille. Très bien, j'ai maintenant une aiguille très fine, de très bonne qualité.
Et voici maintenant un micro-chaudron. Je dois couper l'aiguille à une position précise pour obtenir la taille adéquate de la pipette porte-échantillon. Je chauffe la bille de verre, je descends avec l'aiguille qui fond dessus, et maintenant elle est cassée.
Je repousse ceci. Vous voyez que l'aiguille cassée est parfaite. Maintenant, je descends ici, je monte la chaleur.
Maintenant, la bille de verre deviendra rouge, elle fondra, poussez la bille de verre et elle décrit une courbe. C'est suffisant. Je l'enlève.
Vous voyez, ensuite j'insère l'aiguille. Nous venons de placer la pipette de maintien sous cette tête. Maintenant, réinsérez-la dans le microscope.
Micropipette, capillaire et je l'ai chargé avec du mercure. Je l'ai chargé dans cette pointe. Chargez ce capillaire ici avec du mercure.
Il va à l'intérieur. Placez l'aiguille ici, dans cette tête. Vissez fermement, puis tirez-le vers l'arrière.
Tourner dans le sens horaire ici fera avancer le mercure vers l'avant, ce qui vous permet de le voir. Et maintenant, plongez la pointe dans l'huile. Voyez ? Maintenant, je descends le long de l'aiguille pour obtenir une bonne visibilité.
Expulsez quelques gouttelettes de mercure et aspirez un peu de QVP. Cela ne pose aucun problème. Ensuite, remontez-le à nouveau.
Je me rends au BCCR et descends dans le trou. Je dirige ma tête vers P, qui est la pipette à souris. Je dois préparer une capillaire pour l'insérer ici. Merci. Déjà. Bien.
Alors, préparez un capillaire. D'accord. Et dans le tube, je suis en place.
Je viens de Suisse et j'ai commencé ce travail il y a un an, puis je suis arrivé(e) dans le laboratoire de K'S, où j'ai commencé à apprendre le transfert nucléaire. C'est vraiment un excellent endroit, et c'est formidable d'y travailler. Bien sûr, cette expérience est très complexe et de nombreux problèmes peuvent survenir lors de sa réalisation.
Ainsi, au début, vous pourriez rencontrer des problèmes tels que la lyse de nombreuses cellules pendant que vous induisez la nucléation ou pendant le transfert. Ou bien, vous constatez que, même si le transfert réussit, les cellules ne se développent pas. Il peut toujours y avoir de nombreuses raisons à cela.
Je veux dire que vous pouvez commencer par le système de culture de tous les sites. Il faut donc toujours des témoins, comme les éléments de contrôle génétique ou certains œufs fécondés, pour tester le système de culture et les incubateurs. Vous devez également améliorer les compétences en microscopie.
Il faut donc beaucoup de pratique jusqu'à ce que vous puissiez gonfler le côté de manière fiable, puis transférer à nouveau. Cela relève uniquement de la pratique et cela prendra quelques semaines ou mois avant que vous ne maîtrisiez la technique. Sinon, c'est prêt pour des expériences longues.
Il est donc conseillé de réserver une journée entière pour cette manipulation. En outre, une difficulté au début réside dans la pipette chez la souris. Il faut éviter de former des bulles, bien maîtriser la technique et ne pas perdre de vue ce que l'on fait, car on risque notamment d'endommager un clone, particulièrement en raison du fait que la couche externe, la soie de lucita, est ouverte : en effet, lorsqu'on aspire par la bouche, on peut endommager ce clone et provoquer une fuite hors de cette soie de lucita.
Ainsi, il faut également faire attention à ne pas avoir d'huile dans ce tube buccal. Il ne faut pas trop aspirer ni trop souffler, mais cette compétence est relativement facile à acquérir.
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Aperçu
Ce film et le protocole ont pour but d'aider à l'apprentissage du transfert nucléaire, un processus dans lequel un noyau différencié est reprogrammé en un état embryonnaire.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Neurosciences
- Biologie cellulaire
- Biologie du développement
Contexte
- Le transfert nucléaire est une technique utilisée en clonage et en médecine régénérative.
- La reprogrammation des noyaux est cruciale pour comprendre la différenciation cellulaire.
- Ce processus peut conduire à des avancées dans la recherche sur les cellules souches.
- Comprendre les conditions nécessaires à un transfert nucléaire réussi est essentiel pour son application.
Objectif de l'étude
- Démontrer la technique de transfert nucléaire.
- Fournir un protocole qui facilite le processus d'apprentissage.
- Explorer le potentiel de reprogrammation des cellules différenciées.
Méthodes utilisées
- Préparation d'une boîte avec des réactifs spécifiques.
- Utilisation de l'hyaluronidase dans le processus de transfert nucléaire.
- Étalonnage de l'atmosphère de CO2 pour des conditions optimales.
- Application d'huile minérale pour recouvrir les gouttes pendant la procédure.
Résultats principaux
- Démonstration réussie de la technique de transfert nucléaire.
- Les réactifs utilisés se sont révélés efficaces dans le processus de reprogrammation.
- Les conditions optimales pour le transfert nucléaire ont été établies.
- Le protocole fourni peut contribuer à des recherches et des apprentissages ultérieurs.
Conclusions
- Le transfert nucléaire est une méthode viable pour la reprogrammation des noyaux.
- Comprendre la méthodologie est essentiel pour son application en recherche.
- Le protocole peut servir de base à des études futures dans ce domaine.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle dans le secteur industriel
Le transfert nucléaire permet la reprogrammation de noyaux différenciés vers un état embryonnaire, offrant un modèle mécanistique pour la détection épigénétique des risques lors de la validation de cibles. Cette approche renforce la confiance prédictive dans les stratégies de reprogrammation cellulaire pertinentes pour la médecine régénérative et les thérapies dérivées des cellules souches. La compréhension des principes de reprogrammation nucléaire éclaire la découverte en phase précoce en clarifiant la réversibilité des processus de différenciation et de vieillissement.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Découverte précoce et validation de cibles
- Valeur scientifique : Fournit un système permettant d'interroger des hypothèses thérapeutiques en testant la capacité de reprogrammation nucléaire.
- Valeur opérationnelle : Permet une validation fonctionnelle des cibles grâce à l'évaluation de la réversibilité épigénétique dans les cellules différenciées.
- Valeur prédictive : Facilite le tri des projets en modélisant la faisabilité de la restauration du potentiel développemental des cellules dérivées de patients.
Développement de criblages et de tests
- Prêt du test : Établit des conditions standardisées à l'aide de gouttes recouvertes d'huile minérale et d'une calibration au CO2 pour un transfert nucléaire reproductible.
- Résultats quantitatifs : Permet la mesure du potentiel de développement comme indicateur fonctionnel du succès du reprogrammation.
- Réutilisation de la plateforme : Permet la préparation à grande échelle de réactifs tels que l'hyaluronidase et le SUM/HCCV pour des protocoles expérimentaux cohérents.
Recherche translationnelle et préclinique
- Pertinence pour les maladies : Offre une voie pour générer des cellules souches embryonnaires appariées aux patients afin de modéliser les maladies in vitro.
- Continuité translationnelle : Relie la reprogrammation en phase de découverte à la validation préclinique par l'obtention de cellules souches génétiquement identiques.
- Progrès ajusté au risque : Éclaire les décisions concernant les stratégies de différenciation et de remplacement des cellules souches en fonction de l'efficacité du transfert nucléaire.
Intégration des pipelines et des flux de travail
La méthode s'inscrit dans le continuum de découverte allant du test d'hypothèses sur une cible à l'identification d'un composé précurseur, en particulier dans le cadre de la validation de mécanismes épigénétiques et des tests de reprogrammation cellulaire.
- Biologie de la découverte : Soutient la vérification d'hypothèses sur la capacité des noyaux différenciés à être reprogrammés vers un état embryonnaire.
- Essais de dépistage : Décrit la préparation normalisée des gouttes et l'application d'une couche d'huile minérale pour assurer la stabilité de la culture, garantissant ainsi la prêts des tests.
- Analytique : Met en évidence le potentiel de développement comme paramètre quantitatif clé pour comparer différentes conditions de reprogrammation.
- Recherche translationnelle : Se rattache aux travaux précliniques en permettant l'obtention de cellules souches embryonnaires capables de générer tous les types cellulaires adultes.
- Réutilisation en milieu professionnel : Présente le transfert nucléaire comme une plateforme réutilisable pour évaluer les facteurs de reprogrammation dans divers types cellulaires.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Réduction du risque mécanistique des cibles épigénétiques par démonstration de la faisabilité du reprogrammation nucléaire.
- Valeur opérationnelle : Normalisation grâce à l'étalonnage en CO2, à l'utilisation d'huile minérale et à la préparation des réactifs (par exemple, hyaluronidase, SUM/HCCV).
- Valeur stratégique : Améliore les décisions d'orientation (go/no-go) en médecine régénérative en validant précocement la plasticité cellulaire.
- Impact sur le portefeuille : Permet une priorisation ajustée au risque des approches basées sur les cellules souches en utilisant des cellules génétiquement identiques et appariées au patient.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en micromanipulation, incluant les techniques de tirage d'aiguilles et d'utilisation du micro-foret.
- Dépend d'instruments tels que des microscopes équipés de microinjecteurs et de capillaires chargés au mercure pour la visualisation.
- Exige une standardisation inter-équipes des conditions de culture, notamment l'équilibration en CO2 et les protocoles de recouvrement par huile.
- Implique des adaptations selon les systèmes modèles, en particulier dans la manipulation des ovocytes et l'intégrité de la zone pellucide.
- Est limitée par des défis techniques tels que la lyse cellulaire durant le transfert et l'échec du développement après le transfert, nécessitant une pratique approfondie.
F.A.Q. sur la bio-industrie pharmaceutique
Chapters in this video
2:23
Dish for enucleation and nuclear transfer HCZB/cytocholazin
4:53
Injection pipette
7:07
Oocyte isolation
3:31
Holding pipette
3:30
Preparation of pipettes
10:31
Collection of donor cells
9:43
Nuclear transfer
11:50
Discussion
11:05
Transfer
9:58
Enucleation
6:30
Mouth pipette for oocyte isolation
0:18
Dish for oocyte incubation KSOM
0:00
Introduction
0:17
Preparation of dishes
1:08
Dish for oocyte isolation HCZB and HCZB/hyaluronidase
