Name: Dendra2 photocommutation travers la fenêtre dimagerie mammaire (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-06-05T00:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 12 s
Description: Découvrez la photocommutation intravitale de cellules tumorales marquées au Dendra2 dans le tissu mammaire de souris. Cette technique permet d'imager le comportement métastatique dans son microenvironnement tumoral sur plusieurs jours.

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Ce travail a été soutenu par le Département américain de la Défense (BC075554 à BG et BC061403 à DK), US National Institutes of Health (U54GM064346 d&#39;JvR; CA100324 à JC, JES et JW; CA77522 à JES, U54CA126511 à JC et BG). Nous remercions D. Entenberg de l&#39;aide pour la microscopie, M. Rottenkolber pour les aider dans la fabrication de la boîte de l&#39;imagerie et J. Pollard (Albert Einstein College of Medicine) pour l&#39;anticorps F4/80.

1. Génération des tumeurs fluorescentes à l&#39;aide d&#39;injection de cellules tumorales mammaires dans le pavé gras: <ol><li> Cultivez une lignée cellulaire exprimant Dendra2 protéines (comme un marqueur cytoplasmique) à 40 - 80% de confluence. </li><li> Rincer la vaisselle au moins 3 fois avec du PBS w / o Ca 2 + ou Mg 2 +. </li><li> Ajouter 3 ml de trypsine par 10 cm de plat et incuber à 37 ° C jusqu&#39;à ce que la plupart des cellules se détachent et ensuite frappé du plat contre une surface plane pour le secouer. </li><li> Rincer toutes les cellules hors du plat, et d&#39;utiliser un grattoir (spatule en caoutchouc) pour collecter la matrice ainsi. Ajouter les 5 ml de PBS. Prélever une partie aliquote de compter pendant la centrifugation. </li><li> Centrifuger à 800 g pendant 5 min. </li><li> Aspirer et remettre en suspension dans du PBS à une concentration de 5 - 10x 10 6 / ml. Magasin de la glace jusqu&#39;à injecté (injecter dans les 30 min). </li><li> Placez une cage contenant 4-5 semaines vieilles immunitaire féminin souris déficientes (par exemple SCID) à l&#39;intérieur d&#39;une hotte stérile. </li><li> Pulvériser la zone autour de la 4ème (abdominaux) mamelon avec 70% d&#39;éthanol. </li><li> Injecter 0,1 ml dans coussinet adipeux mammaire. Si un assistant peut être trouvé, une personne peut tenir la souris en place tandis que les autres insertions de l&#39;aiguille à l&#39;intérieur du pad mammaires graisse. Si vous vous injectez vous-même, mettre la souris sous anesthésie légère en utilisant l&#39;isoflurane. </li><li> Une fois la tumeur s&#39;est développée pour 5-7 mm, la fenêtre d&#39;imagerie mammaire (MIW) doit être inséré. Remarque: Vous pouvez également, pour certaines applications, la MIW peuvent être insérés sur le dessus du pavé saine graisse mammaire et les cellules peuvent être injectées par la suite. Cette approche permet l&#39;imagerie de cellules transfectées de façon transitoire dans un environnement physiologique. </li></ol> 2. La fabrication manuelle de la fenêtre d&#39;imagerie mammaire (MIW): <ol><li> MIWs (figure 1A) sont faits de plastique de qualité des tissus afin de garantir la biocompatibilité. Pour la construction manuelle, on utilise 5 ou 10 cm plats. </li><li> Mettez des gants en latex sur. </li><li> Faire chauffer un plat de culture de tissus et creat une surface incurvée en appuyant sur un arrondi, un objet dur contre le plat chaud (nous utilisons un peu de 1 pouce dremmel pour cela). </li><li> Découpez le centre du plat en utilisant une lame de rasoir chauffé. </li><li> Utilisez un petit peu en forme de cône dremmel de faire un trou dans le centre de la coupole en forme de base en plastique (6-7mm de diamètre). </li><li> Faire les bords de la base en plastique complètement lisse en la ponçant avec du dremmel et encore son dépôt. </li><li> Fichier en haut de la base en plastique faisant une surface plane pour la lamelle de verre. Le diamètre de l&#39;déposée, surface plane doit être 9-10mm. </li><li> Collez les circulaires en verre 8mm lamelle (numéro 1) sur la surface aplanie à l&#39;aide de la superglue (colle cyanoacrylate). </li><li> Attendez que la colle sèche (15 minutes). </li><li> Utilisez une aiguille chauffée 26G de faire huit trous suture perforation de l&#39;extérieur (où le verre est) à l&#39;intérieur de la base. Les trous devraient être réparties uniformément autour de la lamelle, 0,5-1mm du bord de la lamelle. </li><li> Élargir les trous à l&#39;aide d&#39;une aiguille 5-0 suture. </li><li> Perforant des trous dans la base en plastique feront la surface interne inégale. L&#39;utilisation de papier de sable, font de cette surface complètement lisse. </li><li> Changer les gants et une brosse de petites particules de plastique de la MIW utilisant une petite brosse. </li><li> Laver la MIW à l&#39;eau déminéralisée. </li><li> Laver la MIW utilisant 70% d&#39;éthanol. Utilisez un coton-tige pour nettoyer le verre de sorte qu&#39;il est complètement transparent. S&#39;il ya des taches de brouillard présents de la vapeur de colle, bien utiliser de l&#39;acétone avec un Q-tip. </li><li> Stériliser le MIW par l&#39;exposition aux UV pendant 3 heures à chaque côté. </li></ol> Semi-manuel de fabrication de la fenêtre d&#39;imagerie mammaire (MIW): Pour fabriquer la base en plastique, nous sommes actuellement en utilisant des moules en silicone coulée créés à l&#39;aide faite à la main MIWs. Le moule est composé de deux parties de caoutchouc de silicone qui font une réplique exacte de l&#39;avant et l&#39;arrière de l&#39;original lorsqu&#39;il est rempli de résine de polyester et puis immédiatement réunis. La résine polyester liquide est mélangé 09h10 et les résultats dans une structure dure lorsqu&#39;il est complètement séché en 48h. Le plastique est protégé contre les UV et les archives sans se décomposer ou de devenir jaune au cours du temps. Après que la base est guéri, les étapes sont réalisées 02.08 à 02.16 de la même manière que pour MIWs manuellement fait. 3. Insertion de l&#39;MIW: <ol><li> La zone autour du mamelon 4 e doit avoir un petit (diamètre 5-7 mm) de tumeurs plusieurs jours / semaines après l&#39;injection des cellules tumorales en fonction du type cellulaire (figure 1B). Combien de temps s&#39;est écoulé après l&#39;injection de cellules exprimant la protéine Dendra2 photoswitchable ou d&#39;autres protéines fluorescentes dépend de la lignée cellulaire utilisée. La tumeur ne doit pas être visiblement nécrotiques, et devrait avoir une peau intacte avec des cheveux sur le dessus de la tumeur. Souris présentant des tumeurs nécrosées doivent être euthanasiés. </li><li> Préparez l&#39;espace stérile pour la chirurgie-fixer un morceau de tissu stériles à l&#39;intérieur d&#39;une hotte stérile. Placer un morceau de stériles gauze dans le milieu, et de jeter une MIWs quelques instruments stériles autour de lui: nous utilisons la norme petits ciseaux, les ciseaux à ressort, pinces microdissecting, forceps microdissecting, porte-aiguille. Gardez stériles Q-tips, une bouteille d&#39;éthanol à 70% et des gants stériles dans le coin de la hotte. </li><li> La souris est anesthésiée dans la hotte stérile à l&#39;aide d&#39;injection IP de 2,5% Avertin (20 pi / g) dans HBSS, ou encore 10 ug / kg de kétamine + 10 pg / g de xylazine (contactez votre Institut en soins des animaux pour les approbations et de la commande). Note: La solution doit être préparée Avertin bi-hebdomadaire, stérilisée par filtration en utilisant un filtre de 0,22 um et stocké que 500 aliquotes à 4 ° C (dans l&#39;obscurité). </li><li> Enlever les poils par le rasage de la zone au-dessus de la tumeur en utilisant un rasoir de petits animaux. </li><li> Retirer le reste de la chevelure à l&#39;aide de crème d&#39;épilation Nair (disponible en pharmacie). Nettoyer la peau à l&#39;aide d&#39;éthanol par immersion Q-tips. </li><li> Transfert de l&#39;animal sur la gaze stérile et appliquer une pommade ophtalmique pour les yeux pour les empêcher de sécher et de l&#39;infection. </li><li> Stériliser la peau avec de la Bétadine et propre avec de l&#39;éthanol à 70%. </li><li> Transfert de l&#39;animal sur un chiffon chirurgical stérile intérieur de la hotte stérile. </li><li> Tirez la peau immédiatement en dedans du mamelon aide de pinces et couper ~ incision de 2mm dans la peau. </li><li> Séparez les sous-tendent pad mammaires graisse de la peau avec des ciseaux de dissection et une pince. La peau et étirer le trou lors de cette étape de séparation à une taille qui va accueillir l&#39;insertion de la MIW. </li><li> Si par hasard un navire est touché pendant l&#39;intervention chirurgicale, de façon stérile Q-tips pour enlever toute trace de sang qui est produit / d&#39;arrêter l&#39;hémorragie de devenir excessif. </li><li> Insérez la MIW telle qu&#39;il n&#39;y ait la peau sur le dessus de la base de MIW et la suture en place à l&#39;aide non-résorbables fil et inverser la coupe aiguille. </li><li> Utilisez le tissu adhésif ou cyanoacrylate pour combler les trous de suture et sécuriser le MIW à la peau. </li><li> Ajouter au TMP-SMX mélange d&#39;antibiotiques: (sulfaméthoxazole 0,6 mg / ml, 0,12 mg triméthoprime / ml) dans la bouteille d&#39;eau en cage pendant 3 jours avant et après la chirurgie. </li><li> L&#39;animal reste sous anesthésie pour 1-4h après injection IP Avertin. Depuis l&#39;opération prend généralement ~ 45min, il est important d&#39;aider l&#39;animal de récupérer par la suite: </li><li> Placez un coussin chauffant la main (37 ° C) (disponible en pharmacie) sur le fond de la cage et le couvrir avec de la gaze. </li><li> Gardez l&#39;animal sur le dessus du pavé jusqu&#39;à ce qu&#39;il tourne sur le ventre et commence à marcher. </li><li> Si l&#39;animal est inconscient depuis plus de 3h, injecter 0,3 ml de HBSS par voie intrapéritonéale pendant la réhydratation. </li><li> L&#39;animal est autorisé à récupérer au fil des jours 3-4 prochaines avant la session d&#39;imagerie première a lieu. </li></ol> 4. Construction Boîte Imaging La boîte d&#39;imagerie assure que la MIW est assis à plat, juste au-dessus de l&#39;objectif du microscope. Il facilite également la température et le contrôle anesthésie par flux d&#39;air constant de l&#39;isoflurane. La boîte est faite de plexiglas et collées ensemble en utilisant soudure plastique. Il est équipé de la platine du microscope spécifique et donc la forme de son fond varie selon le microscope utilisé (figure 2 montre le schéma de la boîte équipée d&#39;étape de Leica microscope SP5). Dimensions de la boîte en centimètres sont L = 11,4 cm, l = 7,6 cm, h = 4,4 cm (figure 2A). Le fond de la boîte se compose d&#39;une plaque creuse, 12.7x8.4 cm en taille, qui s&#39;inscrit à l&#39;intérieur du stade de Leica SP5 microscope, et deux coulissantes &quot;portes&quot;, 5,7 x 5,7 cm_each, qui forment une ouverture circulaire (d = 2,22 cm ) lorsqu&#39;il est fermé. Le MIW s&#39;inscrit dans cette ouverture. La pièce avant contient le trou d&#39;entrée pour la livraison d&#39;anesthésie alors l&#39;une des pièces latérales contient un trou de sortie qui mène à la dépression. Notez que le condenseur et le support de diapositives doivent être retirés avant le placement boîte d&#39;imagerie. 5. Boîte Imaging Utilisez <ol><li> Placez l&#39;animal sous anesthésie à l&#39;isoflurane et d&#39;appliquer une pommade ophtalmique pour les yeux. </li><li> Fixez l&#39;échappement d&#39;isoflurane l&#39;appareil d&#39;anesthésie à l&#39;avant boîte de l&#39;imagerie, à l&#39;extérieur de l&#39;orifice d&#39;entrée (figure 2B). </li><li> Fixez un second tube à l&#39;orifice de sortie de la boîte de l&#39;imagerie. Ce tube doit être fixé sur le filtre à gaz, puis à la dépression. </li><li> Ouvrez le couvercle de la boîte et ouvrez les portes boîte et placer l&#39;animal, côté face MIW le fond, et les portes coulissantes dans la boîte. </li><li> Tenez la boîte et d&#39;ajuster les portes du bas pour que la base MIW est détenu et immobilisé entre eux. La base de MIW devrait être au même niveau que les portes boîte d&#39;imagerie, tandis que la lamelle MIW devrait être de quelques millimètres en dessous de ce niveau. Assurez-vous que le positionnement de la MIW entre le bas des portes coulissantes assure que la lamelle (partie vitrée de la MIW) repose à plat, parallèle à la porte en bas de la boîte. Cela permettra d&#39;assurer concentrant appropriée. </li><li> Basse l&#39;objectif du microscope, pour permettre à l&#39;espace pour le placement de la boîte surhaut de la platine du microscope. </li><li> Placez la boîte sur la platine du microscope, et d&#39;ajuster la scène de telle sorte que la lamelle MIW est au-dessus de l&#39;objectif. </li><li> Concentrer l&#39;objectif et de commencer l&#39;imagerie. </li><li> Tout en utilisant l&#39;isoflurane, l&#39;animal doit être surveillé par une inspection visuelle de la fréquence de la respiration. Cela peut être fait visuellement, ou par la surveillance de la fréquence des artefacts respiratoires apparaissant lors de l&#39;imagerie de collecte (qui peuvent interférer avec l&#39;acquisition de données). Le système MouseOx oxymétrie de pouls (Starr Sciences de la vie Corp) a été utilisé avec succès. De cette façon, les données peuvent être collectées en continu, sans éteindre les lumières allumées dans la pièce à vérifier sur l&#39;animal. Remarque: Après chaque séance d&#39;imagerie, la récupération des animaux devrait être facilitée par un tampon d&#39;emballage petite main de chauffage dans une gaze ou Kimwipes et le mettre sous l&#39;animal dans la cage. Remarque: Si un objectif à immersion est utilisé pour l&#39;image à travers la MIW, le milieu d&#39;immersion (glycérol, eau, huile) doit être nettoyé de la fenêtre d&#39;imagerie. Le MIW devrait être inspecté pour déceler toute fissure ou autre dommage qui pourrait survenir lors de l&#39;imagerie. Cela est essentiel pour la collecte des données lors des séances d&#39;imagerie multiples. </li></ol> 6. Photocommutation et l&#39;imagerie de cellules marquées Dendra2 La procédure est décrite pour le microscope confocal Leica SP5, la puissance du laser dans le plan focal, les objectifs et les options disponibles lorsque vous utilisez le logiciel varient d&#39;autres microscopes confocaux ou l&#39;imagerie multiphotonique mis en place, et donc le protocole décrit ci-dessous doit être utilisée comme un guide afin d&#39;optimiser l&#39;expérience sur votre microscope. <ol><li> En observant la tumeur à travers l&#39;oculaire (10x) avec le filtre de fluorescence verte, de localiser les principaux vaisseaux sanguins qui sont visiblement fluide et à plat dans le même plan focal. </li><li> Position un des navires dans le centre du terrain et passer à la détection PMT. </li><li> Mettre en place la collecte d&#39;imagerie séquentielle pour deux canaux. Un des canaux utilise 488nm ligne laser (10% de puissance), et recueille la diffusion de la matrice extracellulaire (480-495nm) et d&#39;émission de la forme verte de Dendra2 (505-540nm). Le deuxième canal utilise la ligne du laser 543nm (90% de puissance) et recueille les émissions de la forme rouge de Dendra2 (555-600nm). Collecter des images en 3D pré-photocommutation. </li><li> Utilisez l&#39;option de numérisation vers le ROI PHOTOSWITCH une population choisie de cellules en utilisant la ligne du laser 405nm (30% de puissance, les scans 20-40). Recueillir des émissions de la forme rouge de la protéine pour contrôler la commutation. </li><li> En utilisant la même routine séquentielle comme dans 6.3, recueillir l&#39;après-commutation des images en 3D. </li><li> Si photocommutation plus d&#39;une région dans la tumeur, il est conseillé de prendre des photos à travers les oculaires à l&#39;aide d&#39;une caméra numérique, dans les canaux à la fois vert et rouge (figure 3A, B). Cela aidera à l&#39;orientation au cours des séances d&#39;imagerie ultérieurs. Remarque: En outre, les vaisseaux sanguins peuvent être temporairement marqués en utilisant la queue-veineuse injection de dextran fluorescent (Cascade Blue ou Alexa Fluor 647, à la fois 10kDa). Quelques heures après l&#39;injection, les dextranes laissera les vaisseaux sanguins et de façon permanente l&#39;étiquette les macrophages. </li></ol> Les résultats représentatifs: La figure 3C montre une zone rectangulaire photoswitched (rouge) orienté orthogonalement par rapport à la cuve de sang (pas de fluorescence). Non-photoswitched cellules sont vertes, tandis que la dispersion de la matrice extracellulaire est le violet. L&#39;image est une projection d&#39;intensité maximale de quatre images le long de l&#39;axe Z. (20-50 um de profondeur).

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</ol>

<table><tbody><tr><td>PBS sans Ca, Mg</td><td>GIBCO, par Life Technologies</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Tripsine</td><td>GIBCO, par Life Technologies</td><td>25300</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>GIBCO, par Life Technologies</td><td>14025</td><td></td></tr><tr><td>Milieu DMEM (cellules MDA-MB-231)</td><td>GIBCO, par Life Technologies</td><td>11965</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane (Aerrane)</td><td>Baxter Internationl Inc.</td><td># NDC 10019-773-40</td><td></td></tr><tr><td>Souris SCID</td><td>Institut national du cancer</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Plaques de culture</td><td>BD Biosciences</td><td>353003</td><td>Commande personnalisée</td></tr><tr><td>Couvre-objets circulaires de 8 mm</td><td>Scientific, Inc.</td><td>8CIR-1-FIS</td><td></td></tr></tbody></table>

dendra2 photocommutation travers la fenêtre d&#39;imagerie mammaire

Dendra2 Photoswitching through the Mammary Imaging Window

Dans la dernière décennie, la microscopie intravitale des tumeurs mammaires chez la souris et le rat à une seule cellule de résolution<sup&gt; 1-4</sup&gt; A abouti à des informations importantes sur les mécanismes du comportement métastatique telles que la migration, l&#39;invasion et intravasation des cellules tumorales<sup&gt; 5, 6</sup&gt;, L&#39;angiogenèse<sup&gt; 3</sup&gt; Et la réponse immunitaire des cellules<sup&gt; 7-9</sup&gt;. Nous avons récemment rapporté une technique à l&#39;image orthotopique carcinomes mammaires sur plusieurs séances d&#39;imagerie intravitale chez la souris vivante<sup&gt; 10</sup&gt;. Pour cela, nous avons développé une fenêtre d&#39;imagerie mammaire (MIW) et des paramètres optimisés pour l&#39;imagerie Dendra2<sup&gt; 11</supPhotocommutation&gt; et l&#39;imagerie<em&gt; In vivo</em&gt;. Ici, nous décrivons le protocole pour la fabrication de MIW, l&#39;insertion de la MIW sur le dessus d&#39;une tumeur et l&#39;imagerie des cellules tumorales Dendra2 marqué à l&#39;aide d&#39;une boîte d&#39;imagerie sur mesure. Ce protocole peut être utilisé pour l&#39;image du comportement métastatique des cellules tumorales dans des microenvironnements distincts dans les tumeurs et permet à l&#39;imagerie à long terme des vaisseaux sanguins, les cellules tumorales et les cellules hôtes.

Photocommutation intravitale et de suivi des Dendra2 marqué les cellules tumorales à travers la fenêtre d&#39;imagerie mammaire est une technique qui permet d&#39;imager le comportement métastatique des cellules tumorales dans des microenvironnements tumoraux choisis sur une échelle de temps de jour.

Dendra2 photocommutation travers la fenêtre d&#39;imagerie mammaire

Au cours de la dernière décennie, la microscopie intravitale de tumeurs mammaires chez la souris et le rat avec une résolution à l'échelle de la cellule unique1-4 a permis d'obtenir des informations importantes sur...

Ce vidéo illustre un protocole commençant par l'injection d'une lignée cellulaire tumorale exprimant une protéine fluorescente dans le bourrelet adipeux mammaire de la souris. Une chambre spécialisée pour l'imagerie in vivo est ensuite construite et implantée chirurgicalement chez l'animal, moment à partir duquel des données d'imagerie peuvent être acquises. Bonjour, je suis le Dr Vic du laboratoire des Drs John Conde et Jeffrey Siegel du Centre de biophotonique de l'Albert Einstein College of Medicine.Aujourd'hui, nous allons vous présenter une procédure de commutation photo-induite in vivo et d'imagerie de cellules cancéreuses marquées par DRA deux à travers une fenêtre d'imagerie implantée. Nous utilisons cette procédure dans notre laboratoire pour étudier l'influence du microenvironnement tumoral sur la motilité des cellules tumorales. Enfilons donc des gants en latex et commençons.Commencez la fabrication de la fenêtre d'imagerie mammaire, ou MIW, en chauffant une boîte de culture tissulaire de cinq à dix centimètres et en créant une surface courbe en appuyant un objet dur arrondi, tel qu’un foret Dremel de un pouce, contre la boîte. Découpez le centre de la boîte à l’aide d’un rasoir chauffé. Utilisez ensuite un petit foret conique Dremel pour percer un trou de six à sept millimètres de diamètre au centre de la base en plastique de forme bombée.Limez les bords de la base en plastique pour les rendre parfaitement lisses à l’aide d’un Dremel, puis effectuez un ébavurage supplémentaire. Aplatissez le dessus de la base en plastique afin de créer une surface plane pour la lame de couverture en verre. Le diamètre de la surface plane obtenue doit être compris entre neuf et dix millimètres.Ensuite, collez le couvre-objet circulaire en verre de huit millimètres. Faites-le glisser sur la surface aplatie à l’aide de colle super glue et laissez sécher pendant 15 minutes. À l’aide d’une aiguille de 26 G chauffée, réalisez huit trous de suture en perçant de l’extérieur vers l’intérieur de la base ; les trous doivent être répartis uniformément autour du couvre-objet.Déplacez le nwt de 0,5 à un millimètre du bord de la lame. Lavez le MIW avec de l'eau déionisée, puis à nouveau avec de l'éthanol à 70 %. Utilisez un coton-tige pour nettoyer le verre jusqu'à ce qu'il soit complètement transparent.Utilisez de l'acétone pour éliminer toute trace de buée résiduelle provenant de la vapeur de colle. Enfin, stérilisez le MIW en l'exposant à la lumière ultra filet pendant trois heures de chaque côté. Avant d'insérer le MIW, la zone entourant le quatrième mamelon doit présenter une petite tumeur de cinq à sept millimètres de diamètre, résultant de l'injection de cellules tumorales.Dans la première partie, vérifiez que la tumeur n'est pas nécrosée à l'œil nu. La peau autour de la tumeur doit être intacte et présentant des poils. Pour commencer, préparez un espace stérile pour la chirurgie en plaçant un morceau de tissu stérile à l'intérieur d'une hotte stérile.Placez un morceau de gaze stérile au centre et rassemblez les éléments dont vous aurez besoin pour la chirurgie. Vous aurez besoin d'une paire de ciseaux de dissection petits et d'une paire de ciseaux de dissection grands à ressort, de pinces microchirurgicales et de forceps, ainsi que d'un porte-aiguille. Après avoir anesthésié la souris avec 2,5 % d’avertin, utilisez un rasoir pour petits animaux afin de raser la zone située au-dessus de la tumeur. Utilisez une crème dépilatoire pour éliminer les poils restants et nettoyez la peau.À l’aide de cotons-tiges imbibés d’éthanol. Transférez l’animal sur la compresse stérile et appliquez un onguent ophtalmique sur les yeux pour éviter qu’ils ne s’assèchent et ne s’infectent. Stérilisez la peau avec du Bétadine, puis nettoyez-la avec de l’éthanol à 70 %.Avec un champ chirurgical annuel et stérile, tirez la peau immédiatement médiale par rapport au mamelon à l’aide d’une pince et pratiquez une incision d’environ deux millimètres. Séparez le bourrelet graisseux mammaire sous-jacent de la peau par dissection, à l’aide de ciseaux et d’une pince. Une fois séparés, la peau et l’ouverture s’étirent jusqu’à une taille permettant l’insertion du MIW.Insérez le MIW de manière à ce qu'il y ait de la peau au-dessus de la base du MIW, puis fixez-le par points de suture. Utilisez un adhésif tissulaire ou du cyanoacrylate pour combler les trous de suture et assurer la fixation du MIW à la peau. L'animal doit ensuite être laissé en phase de récupération pendant les trois à quatre jours suivants avant la première séance d'imagerie.Pour préparer la séance d'imagerie, nous pouvons décrire la boîte d'imagerie afin d'exploiter cette dernière. Tout d'abord, anesthésiez l'animal à l'isoflurane et appliquez un onguent ophtalmique sur les yeux. Branchez l'évacuation d'isoflurane provenant du dispositif d'anesthésie à l'avant de la boîte d'imagerie.À l'extérieur du trou d'entrée. Fixer un deuxième tube au trou de sortie de la boîte d'imagerie. Ce tube doit être raccordé au filtre à gaz, puis au vide.Ensuite, placez l'animal de manière à ce que l'IMW soit orienté vers le bas. Tenez la boîte et ajustez les portes inférieures afin que la base de l'IMW soit maintenue et immobilisée entre celles-ci. La base de l'IMW doit être au même niveau que les portes de la boîte d'imagerie.Bien que le lamelle du MIW doive se situer à seulement quelques millimètres en dessous de ce niveau, assurez-vous que le positionnement du MIW entre les portes coulissantes inférieures garantit que le lamelle repose à plat, parallèlement aux portes inférieures de la boîte. Cela permettra une mise au point correcte en abaissant l'objectif du microscope pour laisser de l'espace afin de placer la boîte sur la platine du microscope. Ajustez la platine de manière à ce que le lamelle du MIW se trouve au-dessus de l'objectif.Nous pouvons maintenant régler la mise au point de l'objectif et commencer l'acquisition d'images. La procédure d'acquisition décrite ici concerne le microscope confocal Leica SP cinq et doit servir de guide pour optimiser l'expérience avec le microscope particulier utilisé. Commencez par observer la tumeur à travers l'oculaire avec un filtre fluorescent vert.Repérez les principaux vaisseaux sanguins qui présentent un écoulement visible et sont positionnés à plat dans le même plan focal. Placez l'un des vaisseaux au centre du champ et passez à la détection PMT. Nous allons configurer une acquisition d'images séquentielle pour deux canaux.Un canal utilise la ligne laser de 488 nanomètres et recueille la diffusion provenant de la matrice extracellulaire ainsi que l'émission de la forme verte de dendra deux. Le second canal utilise la ligne laser de 543 nanomètres et recueille l'émission de la forme rouge de dendra deux. Acquérir des images 3D avant la commutation photo-induite.Ensuite, utilisez l'option de balayage de la région d'intérêt pour activer photochimiquement une population choisie de cellules à l'aide de la ligne laser de 405 nanomètres. Recueillez l'émission provenant de la forme rouge de la protéine afin de surveiller l'activation. Ensuite, acquérez des images 3D après l'activation selon la même méthode que celle utilisée pour les images avant l'activation.Très bien, donc en utilisant une puissance laser de 20 % dans l'UV pour activer ou convertir cette zone en photo-commutateur, plusieurs régions dans la tumeur, prenez des images à travers les oculaires à l’aide d’une caméra numérique dans les canaux vert et rouge. Cela facilitera l’orientation lors des séances d’imagerie ultérieures. Sur cette image, on observe une zone rectangulaire photo-commutée, orientée orthogonalement par rapport au vaisseau sanguin, qui ne présente aucune fluorescence.Les cellules non photoswitchées apparaissent en vert, tandis que la diffusion provenant de la matrice extracellulaire est violette. L'image est une projection d'intensité maximale de quatre images prises selon l'axe Z. Nous venons de vous montrer comment activer par photoswitching et imager des cellules marquées avec RA tool à travers la fenêtre d'imagerie de la mémoire.Il est important d'utiliser cette procédure afin de comparer les comportements des cellules tumorales dans différentes zones de la tumeur sur plusieurs jours. Voilà, c'est tout. Merci d'avoir regardé et bonne chance avec votre expérience.

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Dans cette vidéo, nous effectuons une imagerie intravitale de cellules cancéreuses pré-injectées dans un modèle murin via une fenêtre crânienne implantée. Cette technique d’imagerie time-lapse à haute résolution permet d’étudier le comportement dynamique des cellules cancéreuses chez la souris vivante.

Imagerie intravitale basée sur la fenêtre crânienne dans un modèle murin : une technique d’imagerie pour étudier le comportement des cellules cancéreuses pré-injectées dans le cerveau d’un modèle murin

Ici, nous décrivons une technique d’administration localisée de réactifs à la glande mammaire du lapin via une injection intracanalaire. De plus, nous décrivons un protocole de visualisation et de confirmation de l’administration par imagerie échographique à haute résolution des agents de contraste.

Livraison Intracanalaire le lapin glande mammaire

Une approche est présentée ici pour l’imagerie intravitale à long terme utilisant des fenêtres en silicone optiquement claires qui peuvent être collées directement sur le tissu / organe d’intérêt et la peau. Ces fenêtres sont moins chères et plus polyvalentes que d’autres actuellement utilisées sur le terrain, et l’insertion chirurgicale provoque une inflammation et une détresse limitées chez les animaux.

Imagerie intravitale longitudinale à travers des fenêtres en silicone transparent

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Microscopie intravitale longitudinale à l’aide d’une fenêtre d’imagerie mammaire avec couvercle remplaçable

La méthode d’imagerie intravitale décrite ici utilise la deuxième génération harmonique de collagène et la fluorescence endogène du cofacteur métabolique NAD(P)H pour segmenter de manière non invasive un microenvironnement tumoral non marqué en compartiments tumoral, stromal et vasculaire pour une analyse approfondie des images intravitales 4D.

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Le présent protocole décrit une technique simple d’imagerie intravitale de la glande mammaire de la souris allaitante par balayage laser, microscopie confocale et multiphotonique.

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Fenêtre stabilisée pour l’imagerie intravitale du pancréas murin

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Une méthode pour le 2-Photon Imaging du flux sanguin dans le néocortex travers une fenêtre crânienne

Le microscope optique est un outil de base pour le biologiste cellulaire, qui devraient avoir une connaissance approfondie de la façon dont il fonctionne, comment il devrait être aligné pour différentes applications, et comment elle devrait être maintenue tant que nécessaire pour obtenir un maximum d'images formant la capacité et la résolution. Les composants du microscope sont décrites en détail ici.

Principales composantes d&#39;un microscope optique

Cellules mammaires tumorales exprimant la luciférase sont implantés sous la peau chez la souris et visualisées à l'aide d'imagerie optique pour surveiller la croissance des tumeurs et le développement de façon non invasive dans une étude longitudinale.

In vivo Bioluminescent imagerie des tumeurs mammaires qui utilisent des fréquences IVIS

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Dendra2 photocommutation travers la fenêtre d'imagerie mammaire

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