Name: Souris disolement surrénales cellules chromaffines (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-01-05T00:00:00.000+00:00
Duration: 18 min 30 s
Description: Apprenez à isoler les cellules chromaffines de la médullosurrénale chez la souris pour étudier le couplage excitation-sécrétion. Cette méthode fournit un système in vitro fiable pour la recherche en neuroendocrinologie.

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Abréviations: ACC - surrénales cellules chromaffines, E. sol. - solution d&#39;enzyme, E. DMEM - Enrichi Dulbecco Modified Eagle Médium <ol><li> Préparation <ol><li> Ajouter à la papaïne quantité désirée de E. sol. (40 unités papaïne / 1ml E. sol..). </li><li> Activer la papaïne avec carbogène pendant environ 15 minutes sur la glace. Oxygéner Locke tampon sur la glace aussi. </li></ol></li><li> Dissection <ol><li> Utilisez la souris 8-10 semaines. </li><li> Avant de retirer la digestion oxygénée tampon de Locke et de placer sur la glace. </li><li> Reportez-vous à la vidéo pour la procédure de dissection. </li><li> Une fois excisée, les glandes place dans oxygénée tampon de Locke. </li></ol></li><li> Préparation de Gland <ol><li> Retirez la graisse de la glande. </li><li> Bande de cortex de la glande. </li></ol></li><li> Digestion enzymatique <ol><li> Filtre stérile oxygéné papaïne. </li><li> Faire quatre piscines de la papaïne oxygénée sur une boîte de Pétri. <ol><li> 3 piscines devrait être d&#39;environ 100uls. </li><li> Une des piscines devrait être d&#39;environ 400uls. </li></ol></li><li> Lavez médullaire travers des piscines <ol><li> 1er au 3 piscines 100ul. </li><li> Puis, à travers la piscine 400ul </li><li> Pippette 300ul E. sol. et la moelle des morceaux de la piscine 400ul en tube de centrifugeuse. </li><li> Qrap parafilm sur le tube de centrifugeuse et le lieu de 37 ° C bain d&#39;eau pendant 20 minutes. </li><li> N&#39;oubliez pas de continuer à oxygéner restantes sol. E. contenant de la papaïne. </li><li> Après 20 minutes stériles filtre plus E. sol.. </li><li> Remplacer les vieux médullaire E. bain sol. avec le nouveau filtrée E. sol.. </li></ol></li></ol></li><li> Triturations <ol><li> Aspirer et jeter E. sol.. </li><li> Lavez médullaire dans 1 ml de DMEM E.. </li><li> Aspirer et jeter E. DMEM. </li><li> Ajouter 300ul E. DMEM et triturent 20X avec 1ml pointe. </li><li> Coupez le bout 200ul avec une lame de rasoir stérile. </li><li> Triturer 5-10X avec pointe 200ul coupé. </li><li> Jeter E. morceaux DMEM médullaire de bain. Medium contiendra les débris. </li><li> Ajouter 300uls fraîches E. DMEM à médullaire morceaux. </li><li> Triturer 20x avec la pointe 200ul </li><li> Pippette E. DMEM à microcentrifugeuse tubes withough pièces médullaire. Medium contiendra ACC libre. </li><li> Ajouter 300uls fraîches E. DMEM à médullaire morceaux. </li><li> Triturer médullaire avec une aiguille de calibre 23,5 seringue 20x. </li><li> Combinez E. DMEM des deux triturations. Médullaire morceaux ne devraient pas être présents et doivent maintenant avoir une apparence de plumes. </li></ol></li><li> Placage <ol><li> Microfuge E. DMEM à partir des deux dernières étapes de trituration pour les 2,5 minutes à 3,7 g s. </li><li> Resuspendre le culot dans 50uls-200 E. DMEM, selon des expériences ultérieures. </li><li> Planche 10-30uls sur une lamelle de verre. </li><li> Attendre 15 minutes pour les cellules d&#39;adhérer. </li><li> Ajouter 750uls de E. DMEM. </li></ol></li></ol>

Les auteurs n'ont rien à divulguer.

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