Combinant des nerfs périphériques et de greffe matrice de modulation de réparer le cordon Rat épinière lésée

La préparation du greffon d'un nerf périphérique dans un site de lésion de la moelle épinière commence par la pré-dégénérescence du PNG, sept à dix jours avant la greffe. La branche tibiale du nerf d'un rat donneur est sectionnée. Une hémisectomie au niveau cervical cinq, ou C5, est réalisée par aspiration.

Le PNG est prélevé sur le rat donneur et placé contre la paroi rostrale de la cavité lésionnelle, puis fixé par des points de suture en or au niveau de la dure-mère. Trois semaines plus tard, une lésion du quadrant dorsal est réalisée au niveau de C7 ; une éponge de gel saturée en C-H-A-B-C est introduite dans la cavité pendant 15 minutes afin de digérer les protéoglycanes de la cicatrice gliale. Deux jours plus tard, le C-H-A-B-C est micro-injecté à proximité du site lésionnel et l’extrémité distale du PNG est mise en contact avec la lésion du quadrant dorsal.

Bonjour, je suis John Hula. Je suis directeur du centre de recherche sur les lésions médullaires au Collège de médecine de l'Université Drexel. Je suis le Dr Veronica Tom du laboratoire Hula et je suis Martha Mean.

Depuis le laboratoire de Hula. Aujourd'hui, nous allons démontrer une procédure de transplantation d'un segment de nerf périphérique dans la moelle épinière lésée d'un rat adulte. Nous utilisons cette procédure dans notre laboratoire pour étudier la régénération des axones et le rétablissement de la fonction après une lésion de la moelle épinière.

Commençons. Pour vous préparer à une chirurgie microscopique, désinfectez le poste chirurgical et stérilisez tous les instruments chirurgicaux au autoclave. Préparez la barrière thermique ainsi que les petits morceaux de mousse de gel inférieurs à deux millimètres cubes destinés à l’hémostase microchirurgicale.

Préparez des cotons-tiges, des compresses et des instruments chirurgicaux. Placez le rat anesthésié sur la table de préparation après avoir confirmé, à l’aide d’une pincée du orteil, que l’animal est complètement anesthésié. Rasez une vaste zone de poils dans le champ chirurgical prévu, puis lavez le site opératoire en suivant la technique de friction aseptique décrite dans le protocole de texte accompagnant.

Placez ensuite le rat sur la barrière thermique, couvrez son nez et sa bouche avec le cône d'inhalation et réduisez l'isoflurane à 3 % et le débit à 0,2 litre par minute. Administrez la dose appropriée d'antibiotique ampicilline par injection sous-cutanée et d'analgésique buprénorphine par injection intramusculaire. Le nerf périphérique ou PN est sectionné de sept à dix jours avant son prélèvement afin de favoriser la dégénérescence, ce qui crée un environnement plus propice à la croissance axonale qu'une préparation de nerf fraîchement isolé.

Pour commencer la section du nerf pn, placez l'animal sur le côté. Changez pour des gants stériles et disposez un champ opératoire stérile autour du site chirurgical. Pratiquez une incision linéaire allant de la tête du fémur jusqu'au genou, en restant parallèle au fémur et à environ trois millimètres de celui-ci, puis sectionnez le muscle biceps fémoral superficiel selon la même ligne que l'incision cutanée afin d'exposer le muscle vaste latéral sous-jacent.

Une fois le muscle vaste latéral exposé, utilisez des ciseaux pour pratiquer une petite incision près du genou et prolongez-la vers la tête du fémur. Séparez délicatement avec des rétracteurs le vaste latéral jusqu'à ce que les branches tibiale et péronéenne conjointes du nerf sciatique soient visibles, courant parallèlement au fémur. Ensuite, suivez ces branches nerveuses en direction de la tête du fémur jusqu'à ce que le tronc principal du nerf sciatique soit identifié.

Juste en dessous de la bifurcation du nerf sciatique, utilisez une pince fine pour séparer soigneusement le tissu conjonctif ou l'épinéurium entourant la branche du nerf tibial. Il s'agit de la branche la plus volumineuse. Une fois la branche du nerf tibial isolée, passez un ligature de soie de six zéro autour de celle-ci et serrez-la.

Utilisez des ciseaux microchirurgicaux pour sectionner le nerf juste en amont du ligature. Faites passer le fil de suture à travers le muscle vaste latéral et nouez-le. Cela fournira une repère pour localiser facilement l'extrémité coupée du nerf tibial.

Lorsque le nerf est prélevé. Ensuite, fermer le muscle vaste latéral à l’aide de six points de suture en soie. Après cela, fermer le muscle des chefs du biceps avec six points de suture en soie.

Enfin, fermez la peau avec des agrafes chirurgicales Michelle. Arrêtez l'écoulement d'isoflurane et retirez le cône d'inhalation. Placez l'animal dans une cage d'attente sur une barrière thermique.

Replacer l'animal dans sa cage d'origine. Une fois qu'il est alerte et actif, sept à dix jours plus tard, le segment de nerf périphérique (PN) est prêt à être prélevé. Pour commencer la transplantation, placer l'animal anesthésié sur la barrière thermique.

Après avoir confirmé que l'animal est complètement anesthésié, retirer les agrafes de la plaie et écarter l'incision cutanée. Il peut ne pas être nécessaire de raser la zone au préalable, car la peau doit s'écarter facilement, évitant ainsi toute contamination. En évitant de devoir couper à travers le pelage, sectionner le point de suture du muscle superficiel pour exposer le vaste latéral, puis sectionner le point de suture dans ce muscle.

Relevez la ligne de suture jusqu’à l’extrémité coupée du nerf tibial et retirez la suture du nerf. Utilisez une pince fine pour disséquer l’épinéurium sur un segment de 15 millimètres de longueur du nerf tibial, puis sectionnez cette extrémité distale. Retirez le segment nerveux et immergez-le dans une solution saline équilibrée de Hank stérile.

Nous sommes désormais prêts pour l'étape suivante, qui consiste à induire une lésion de la moelle épinière en vue de la transplantation du nerf périphérique, laquelle peut être autologue ou hétérologue. Placer le rat anesthésié sur la barrière thermique et administrer les antibiotiques et analgésiques comme décrit dans la section précédente afin d'induire une lésion médullaire hémisectionnelle. Localiser d'abord l'incisure occipitale et l'épineuse dorsale thoracique T2 bien marquée.

Réalisez une incision sur toute la longueur entre ces repères externes. Coupez le long de la ligne médiane du muscle trapèze superficiel et séparez les muscles cervicaux ardis sous-jacents. Insérez un écarteur pour maintenir les muscles écartés.

Les muscles profonds sus-épineux doivent être sectionnés au niveau des apophyses vertébrales dorsales de C4, C5 et C6. À l’aide de pinces de R jurés, réalisez une laminectomie partielle de C5 afin d’exposer toute la face droite et la portion médiale de la face gauche de la moelle épinière. Utilisez la veine dorsale proéminente comme repère pour la ligne médiane de la moelle épinière.

Ensuite, utilisez une lame de scalpel microchirurgical pour percer la dure-mère et prolonger l'incision au niveau de la moelle épinière C cinq. Pratiquez une petite incision dans l'espace sous-arachnoïdien et la pie-mère sous-jacente à l'aide d'une microcannule en verre étirée. Commencez à aspirer le côté dorsal droit de la moelle épinière en appliquant une pression douce et en utilisant des microforceps pour séparer le tissu et faciliter son retrait.

Poursuivez à travers les portions intermédiaires et ventrales de la moelle épinière afin de créer une cavité de deux millimètres de long, complète de la partie dorsale à la partie ventrale et de la ligne médiane jusqu’aux méninges latérales. Placez de la mousse de gel imbibée de solution saline dans la cavité lésionnelle de la section HEMI. Pour obtenir l’hémostase, retirez le segment de nerf périphérique prélevé auparavant de la solution de Hank.

Palper délicatement l'épi des trois millimètres proximaux du segment nerveux et appliquer cette extrémité contre la paroi rostrale de la cavité de la lésion de la section HEMI. Fixer le segment à l'aide de sutures 10/0 à travers l'épi uum jusqu'à la dure-mère. Puis suturer la dure-mère fermée au-dessus de l'extrémité implantée de la greffe, en sandwichant la greffe entre deux morceaux de membrane élastique en cel.

Placer la greffe le long des apophyses vertébrales C6, C7 et T1. Ne pas mettre en regard l'extrémité distale du nerf avec la moelle épinière ou un tissu musculaire. Fermer les muscles par plans avec des sutures 4-0 et fermer l'incision cutanée à l’aide de clips chirurgicaux.

Enfin, placer l'animal dans une cage d'attente sur une barrière thermique et le ramener à sa cage d'origine. Une fois qu'il est alerte et actif, les axones régénérés qui atteignent l'extrémité distale de la greffe de NP échouent souvent à s'étendre à nouveau dans la moelle épinière. Nous utilisons donc des micro-injections de chondroïtine ACE pour dégrader le tissu cicatriciel entourant la zone lésée.

Cette procédure est réalisée 21 jours après la transplantation PN pour commencer, en confirmant que l'animal est complètement anesthésié. Ensuite, retirer les agrafes de plaie et administrer des antibiotiques et des analgésiques comme indiqué précédemment. Couper les sutures superficielles afin d'exposer la membrane élastique entourant la greffe nerveuse à l'aide de pinces fines et de ciseaux à ressort.

Détacher soigneusement la longueur du nerf des membranes élastiques du cel. Écarter le nerf du champ opératoire. Réaliser une laminectomie partielle du côté droit du processus vertébral de C7.

Percez les méninges avec une lame de microscalpel et, par aspiration, préparez une cavité lésionnelle dorsale d'un millimètre cube dans la moelle épinière au niveau cervical sept. Placez de la mousse de gel imbibée de sérum physiologique dans la cavité lésionnelle pour obtenir l'hémostase. Ensuite, remplacez la mousse de gel par une autre imbibée de chondroïtine nace.

A BC. Traitez le site de la lésion pendant 15 minutes, en fournissant toutes les cinq minutes une éponge de gel imbibée de chondroïtine fraîche. Recouvrez la longueur externe de la greffe nerveuse avec une membrane scolaire. Fermez les muscles superficiels avec quatre points de suture en soie et l'incision cutanée avec des agrafes chirurgicales.

Placer l'animal dans une cage de contention sur une barrière thermique et le ramener à sa cage d'origine une fois qu'il est éveillé et actif. Deux jours plus tard, soit 23 jours après la greffe de PN, une nouvelle intervention chirurgicale est réalisée sur l'animal afin d'injecter par micro-injection du chondroïtine NA dans la moelle épinière. Comme précédemment, les pinces de fermeture sont retirées de l'animal anesthésié et des antibiotiques ainsi que des analgésiques sont administrés.

Couper les sutures superficielles afin d'exposer la membrane élastique entourant la greffe nerveuse. Exposer le site de greffe du septième nerf cervical sans perturber la greffe. Puis utiliser une seringue Hamilton munie d'une canule en verre étirée pour injecter par micro-injection un microlitre de chondroïtine acé A BC dans le côté droit de la moelle épinière, à environ un millimètre en aval de la jonction entre la greffe et la moelle épinière.

Détacher délicatement l'EUR des deux millimètres distaux du segment nerveux et appliquer cette extrémité contre la cavité de la lésion C7. Fixer le segment à l'aide de sutures 10/0 à travers l'épinéurium jusqu'à la dure-mère. Fermer les muscles superficiels avec quatre sutures 4/0 et l'incision cutanée à l'aide de clips de plaie.

Placer l'animal dans une cage de contention sur une barrière thermique et le ramener dans sa cage d'origine une fois qu'il est éveillé et actif. Lorsque cette procédure est optimisée, le segment de nerf périphérique s'intègrera étroitement à la moelle épinière hôte afin de visualiser les axones médullaires qui régénèrent dans la greffe. Nous avons réalisé un remplissage par diffusion de la greffe avec de l'amine de dextrine biotinylée ou du BDA ascendant et descendant.

Les axones médullaires pénètrent généralement dans la greffe, poussent en ligne relativement droite parallèlement à la longueur de la greffe et s'étendent jusqu'à l'extrémité distale de celle-ci à une vitesse d'environ un millimètre par jour. Les axones des nerfs périphériques pénètrent dans la moelle épinière adjacente. Si la chondroïtine NACE a été utilisée pour éliminer les protéoglycanes inhibiteurs des tissus cicatriciels environnants à l'arrivée à l'extrémité distale, très peu d'axones des nerfs périphériques s'étendent dans le tissu hôte après traitement lorsqu'ils sont traités avec le véhicule.

Cependant, si l'interface distale a été traitée avec de la chondroïtine, un nombre significativement plus élevé d'axones émerge du greffon pour réinnervater la moelle épinière. Comme le montre ici cette section représentative parmi 15 à 20 sections par animal où une régénération axonale est observée, ce graphique en barres illustre une augmentation significative de la régénération axonale après le traitement par conjoin nace A BC. La détection immunochimique de marqueurs synaptiques sur les neurones de la moelle épinière en réponse à une stimulation électrique des axones à l'intérieur du greffon peut être utilisée pour évaluer la connectivité fonctionnelle entre le greffon transplanté et la moelle épinière hôte.

Cette région de la moelle épinière contenant le site d'opposition distal a été colorée par immunocytochimie pour la dextrine-amine biotinylée en vert et le marqueur synaptique synapsine en rouge. Les flèches indiquent des zones où une colocalisation des marqueurs a été observée, suggérant que certaines fibres ayant régénéré à partir de la greffe ont formé des contacts synaptiques fonctionnels. La connectivité fonctionnelle entre les neurones de la greffe et ceux de la moelle épinière a également été démontrée par un dosage de l'expression des CFOs. Après stimulation synaptique des neurones hôtes au-delà de l'interface distale, ce marqueur d'activation transsynaptique peut être détecté dans de nombreux neurones positifs pour les CFOs dans le tissu ipsilatéral au site de greffe, et en plus forte augmentation, très peu de neurones positifs pour les CFOs sont observés dans le tissu controlatéral à la greffe.

Nous venons de vous montrer comment préparer un site de lésion de la moelle épinière en vue de la greffe d'un nerf périphérique afin de favoriser la régénération après une lésion de la moelle épinière. Lors de cette procédure, il est important de garder à l'esprit qu'il faut disposer d'une longueur suffisante de nerf avant la greffe et assurer une apposition étroite du greffon au site de la lésion médullaire. Voilà donc tout.

Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.