Une In Vitro Test d'irritation cutanée (SIT) en utilisant le EpiDerm humaine reconstruite épidermique (RHE) Modèle

Epiderm est un modèle reconstruit in vitro de l'épiderme humain, dérivé de cellules humaines normales, mis au point par la société Matt Tech Corporation. Le protocole de test d'irritation cutanée Epiderm validé par EC VM remplace les tests traditionnels sur animaux pour des produits tels que les cosmétiques, les matières premières et les agents industriels destinés à entrer en contact avec la peau humaine. Ce test débute au jour zéro, lorsque le kit d'irritation cutanée et le tissu Epiderm arrivent au laboratoire, puis sont préconditionnés dans un milieu d'essai après une incubation nocturne.

Le premier jour, la surface atypique du tissu épidermique est exposée pendant une heure à un composé irritant putatif, puis l'irritant est éliminé par une étape de lavage le deuxième jour. Après une incubation de 24 heures, l'insert de culture est placé dans un milieu frais et l'ancien milieu peut être utilisé pour l'analyse des cytokines et chimioquines libérées. Le tissu est mis en réaction avec un composé appelé MTT, qui est converti par la réductase mitochondriale en un sel violet foncé formazan.

Fournissant une mesure de la viabilité cellulaire. L'absence de couleur violet foncé dans l'échantillon indique une viabilité réduite. Lorsque la mesure colorimétrique d'un composé test est inférieure à 50 % de celle des témoins négatifs, le composé test peut être classé comme irritant.

Bonjour, je suis Helena Kava de Matt Corporation. Aujourd'hui, nous allons vous présenter la procédure de test d'irritation cutanée in vitro à l'aide d'un modèle épidermique humain reconstitué, epiderm. Cette procédure peut être utilisée, selon les exigences réglementaires, comme remplacement total ou partiel du test d'irritation cutanée rapide in vivo.

Cette nouvelle procédure in vitro peut être utilisée pour l'identification des dangers et l'étiquetage de produits chimiques et de matières premières cosmétiques. Commençons donc. Epiderm est dérivé d'une culture de kératinocytes épidermiques humains afin de former un modèle tridimensionnel, multicouche et hautement différencié de l'épiderme humain.

Les tissus sont mitotiquement et métaboliquement actifs, imitant étroitement leurs homologues in vivo tant sur le plan structurel que biochimique, et ce avec une reproductibilité garantie, tout comme l'épiderme humain. Epiderm est composé de couches basales, épineuses et granuleuses organisées ainsi que d'un stratum corné multicouche. Cette dernière couche contient des couches lipidiques lamellaires intercellulaires de Miller disposées selon des motifs analogues à ceux observés in vivo.

Ces tissus sont cultivés dans un milieu sans sérum. Chaque tissu est développé dans un insert de culture cellulaire individuel. D'autres configurations sont disponibles, notamment un format à haut débit de 96 puits.

La production de tissus prend environ trois semaines pour être complétée. À un stade précis de ce processus, le tissu est élevé à l'interface air-liquide et tout liquide est retiré de la surface APIC du tissu. Les tissus ne sont nourris qu'à travers la surface basolatérale, qui reste en contact avec le milieu de culture propriétaire de Mat Tech. Un kit Epiderm typique contient 24 tissus, chaque tissu ayant un diamètre de neuf millimètres, placés dans leur propre insert de culture tissulaire, ainsi qu'une quantité suffisante de milieu d'essai pour effectuer ce test d'irritation cutanée.

Les 24 inserts sont fermement positionnés sur du gel rose AGA imprégné de milieu, un tissu par puits, dans une plaque standard de 24 puits. L'expédition s'effectue par transporteur express à une température de trois à quatre degrés Celsius avant de commencer les essais chimiques. À l'aide du système de test EPIDERM, préparez et stérilisez tous les instruments et outils utilisés dans le dosage conformément à ce qui est décrit dans le protocole écrit. Une partie des matériaux, comme les cotons-tiges, doit être fournie en emballage stérile ou être autoclavée.

De l'éthanol à 70 % doit être utilisé pour stériliser les instruments tels que les pinces, et une irradiation UV ou gamma doit être utilisée pour stériliser les bouteilles de lavage. Deux solutions essentielles utilisées dans le test doivent être préparées au préalable : le DPBS et une solution de SDS à 5 %. Dans de l'eau distillée, environ deux litres de DPBS stérile, de pH sept, seront utilisés dans le test, un kit contenant 24 tissus épidermiques.

Le DPBS stérile sert de contrôle négatif ainsi que de solution de lavage. Le SDS à 5 % doit être préparé et utilisé comme contrôle positif. Le test d'irritation cutanée commence dès réception du kit EPIDERM EPI 200 SIT.

Vérifiez l'intégrité de tous les composants du kit et contactez immédiatement la société Mat Tech en cas de problème ; si tout est présent, passez à l'étape suivante. Pour commencer le test, laissez le milieu d'essai fourni avec le kit atteindre la température ambiante. Ne préchauffez pas dans la hotte à flux laminaire.

Préparez une plaque stérile à six puits pour chaque groupe de trois inserts de tissu épidermique et pipetez 0,9 millilitre de milieu d'essai dans chaque puits en conditions stériles. Ouvrez le sachet en plastique contenant la plaque à 24 puits avec les tissus épidermiques sous flux d'air stérile. Retirez le gaz stérile et utilisez des pinces stériles pour extraire soigneusement chaque insert contenant le tissu épidermique.

Retirer tout résidu d'aros adhérant aux côtés extérieurs de l'insert en tamponnant délicatement sur de la gaze stérile ou du papier filtre. Ensuite, placer les tissus dans une plaque stérile vide de 24 puits dans les cinq minutes suivantes. Examiner visuellement les inserts.

Enregistrez tout défaut du tissu et tout excès d'humidité en surface. N'utilisez pas les tissus défectueux ou les tissus complètement recouverts de liquide.

Inserts de tissu optimaux. Doivent présenter une surface sèche et être exempts de détachements, de parties irrégulières ou d'excès de liquide en surface. Ensuite, à l’aide d’un coton-tige stérile, séchez soigneusement la surface des tissus.

Évitez de toucher directement le tissu. Les effets capillaires suffisent à éliminer l'humidité de la surface après le séchage. Transférez trois tissus vers la rangée supérieure de chaque groupe de six.

Plaque de culture préremplie avec 0,9 millilitre de milieu d'essai. Libérez toutes les bulles d'air piégées sous les inserts. Ensuite, placez les plaques à six puits contenant les inserts dans l'incubateur pendant une heure.

Pré-incubation à 37 degrés Celsius. À la fin de la première période de pré-incubation, transférez les inserts des puits supérieurs vers les puits inférieurs de la plaque à six puits. Replacez les plaques dans l'incubateur pour une pré-incubation nocturne.

Placer le reste du milieu d'essai dans le réfrigérateur. Après la préincubation nocturne, les produits chimiques d'essai peuvent être appliqués sur les inserts de tissu épidermique. Avant de commencer l'essai d'exposition aux produits chimiques, placer tous les dispositifs, solutions et produits chimiques d'essai nécessaires à température ambiante.

Dans la hotte stérile, essuyez tous les flacons de matériel non stérile avec de l'éthanol à 70 % avant de les placer à l'intérieur de la hotte. Le contrôle négatif, le DPBS stérile, le contrôle positif, le SDS à 5 % et l'eau distillée doivent être placés dans la hotte et portés à température ambiante. Un grand flacon doit être mis de côté pour les déchets.

Préparez une plaque de six puits pour chaque produit chimique en remplissant uniquement la rangée supérieure avec 0,9 millilitre de milieu d'essai par puits. Étiquetez chaque plaque avec le numéro du tissu et le nom du produit chimique.

Environ cinq minutes avant l'exposition prévue aux produits chimiques, retirez les plaques à six puits contenant les tissus préconditionnés de l'incubateur. Évaluez ensuite visuellement la surface des tissus.

Éliminer toute humidité à l’aide de cotons-tiges stériles et ne pas appuyer sur la surface du tissu. Enfin, étiqueter les couvercles de la plaque à six puits avec les codes ou les noms des matériaux testés. Ne pas tester plus de six produits chimiques, y compris les contrôles négatif et positif, chacun en triple exemplaire, lors d’un même essai.

Utilisez une application chimique et un intervalle de lavage d'une minute pour manipuler les substances témoins connues. Suivez les instructions fournies dans la fiche de données de sécurité ou FDS pour les échantillons codés ou inconnus. Respectez les consignes de sécurité chimique et utilisez une hotte ventilée.

Portez des gants et protégez vos yeux et votre visage. Appliquez les produits chimiques sur les tissus à des intervalles d'une minute afin de faciliter le rinçage des produits chimiques d'essai après exposition ; gardez les plaques contenant les tissus traités dans la hotte à flux laminaire jusqu'à ce que le dernier tissu soit traité. Une pipette munie d'une ampoule en bout sera utilisée tout au long de la procédure pour manipuler les tissus et les composés d'essai. Une flamme de bec Bunsen peut être utilisée pour former l'embout en forme de bulbe destiné aux produits chimiques liquides.

Distribuez 30 microlitres de l'échantillon liquide à tester directement sur la surface du tissu et déclenchez immédiatement le chronomètre afin qu'il commence à compter. Placez le treillis en nylon à la surface du tissu. Lorsque le chronomètre atteint une minute, ajoutez le second composé liquide. Utilisez trois tissus par produit chimique testé, en veillant à ajouter chaque composé à des intervalles d'une minute.

Pour tester les produits semi-solides, utilisez une pipette à déplacement positif pour distribuer 30 microlitres directement sur le tissu. Si nécessaire, étalez le produit chimique à l’aide d’une pipette Pasteur afin d’obtenir une surface équivalente à celle du tissu. Peu de temps avant l’application de la substance solide, humidifiez la surface du tissu avec 25 microlitres de DPBS stérile afin d’améliorer le contact entre la surface du tissu et le produit chimique à tester ; remplissez ensuite une cuillère à application pointue de 25 milligrammes avec le matériau finement broyé.

Appliquez la substance d'essai solide sur la surface du tissu. Si nécessaire, utilisez une poire stérile fixée à votre pipette pour vider complètement la cuillère. Secouez doucement les inserts pour favoriser la répartition du solide à la surface.

Vous pouvez également utiliser l'embout sphérique de votre pipette pour ajuster le volume au diamètre du tissu. N'appuyez pas sur la surface du tissu. Enfin, appliquez le DPBS comme contrôle négatif et le SDS à 5 % comme contrôle positif sur les inserts de tissu, également en triplicat, après administration sur le dernier tissu, puis transférez toutes les plaques dans l'incubateur humide à 37 degrés Celsius pendant 35 minutes, plus ou moins une minute.

Pendant cette incubation, veillez à placer tous les matériaux nécessaires aux étapes de lavage dans la hotte. À l’issue de l’incubation de 35 minutes, retirez toutes les plaques de l’incubateur. Placez-les dans la hotte stérile et attendez une période de 60 minutes afin que l’exposition chimique soit terminée pour les tissus traités à la première dose.

Ensuite, commencez la procédure de lavage. Rincez les tissus avec du DPBS stérile 15 fois. Pour éliminer tout résidu de produit test, remplissez l'insert de tissu à l'aide d'un flux constant de DPBS fourni à 1,5 centimètre du tissu et videz-le.

Veillez à ce que le flux de DPBS ne soit pas trop fa faible, sans quoi la substance d'essai ne sera pas éliminée. Respectez un intervalle d'une minute pour laver quatre tissus avec un tamis en nylon, effectuez cinq lavages et retirez soigneusement le tamis à l’aide de pinces fines et pointues. Puis poursuivez avec les 10 lavages restants après le 15e, rincez en immergeant complètement l'insert dans un flacon de lavage, effectuez trois rinçages avec 150 millilitres de DPBS et agitez afin d'éliminer le résidu de la substance d'essai.

Enfin, rincez le tissu. Insérez une fois par l'intérieur et une fois par l'extérieur avec du DPBS stérile. Éliminez tout excès de DPBS du tissu en secouant doucement l'insert et en l'essuyant sur du papier absorbant stérile.

Ensuite, transférez les inserts de tissu transférés sur membrane vers la nouvelle plaque de six puits préalablement remplie de milieu d'essai. Rappelez-vous encore une fois que toutes ces étapes doivent être effectuées dans l'intervalle d'une minute afin de maintenir une durée d'exposition de 60 minutes pour chaque échantillon exposé. Après le rinçage du dernier tissu, séchez soigneusement la surface de chaque tissu à l’aide d’un applicateur stérile à embout cotonneux.

Si des traces de la substance chimique sont encore présentes sur la surface, essayez de les éliminer à l’aide du coton-tige stérile. Incubez enfin les tissus dans l’incubateur pendant les 24 heures suivantes. Notez l’heure de début de l’incubation sur la feuille de documentation des méthodes.

Enregistrez également toutes les différentes applications sur la fiche de documentation de la méthode. Joignez à la procédure opératoire normalisée fournie par Mat Tech Corporation le déplacement des plaques dans la hotte. Transférez l'insert dans la partie inférieure de la plaque à six puits préremplie avec 0,9 millilitre de milieu.

Prélèver le milieu de la rangée supérieure et le transférer dans une plaque 24 puits préalablement étiquetée, puis placer la plaque à moins 20 degrés Celsius. L'analyse des cytokines et/ou chimiotactines libérées dans le milieu de culture est une étape facultative avant l'analyse. Poursuivre l'incubation pendant encore 18 heures, plus ou moins trois heures, pour le test MTT. Étiqueter 2 plaques 24 puits avec les noms chimiques ou les codes.

Veillez à porter des gants de protection, car le MTT est toxique lors de la manipulation. Préparez la solution de MTT en décongelant le concentré de MTT et en le diluant avec le diluant de MTT.

Protéger de la lumière car le MTT est sensible à la lumière et l'utiliser dans les deux à trois heures suivant sa préparation. Comme le MTT se dégrade au fil du temps, pipeter 300 microlitres de milieu contenant le MTT dans chaque puits de la plaque 24 puits. Retirer maintenant les plaques 6 puits de l'incubateur.

Épongez le fond des inserts sur du papier buvard et transférez-les dans la plaque 24 puits préremplie de MTT. Placez la plaque 24 puits dans l'incubateur et incubez pendant trois heures. N'oubliez pas d'enregistrer l'heure de début de l'incubation au MTT dans le DMS ; respectez strictement la durée d'incubation de trois heures afin d'éviter d'obtenir des mesures de MTT variables. Une fois l'incubation au MTT terminée, utilisez une pompe à aspiration équipée d'un piège à déchets toxiques pour aspirer délicatement le milieu de MTT de tous les puits.

Remplissez à nouveau les puits avec du DPBS et aspirez. Répétez ce rinçage deux fois supplémentaires et assurez-vous que les tissus sont secs après la dernière aspiration. Après les lavages, transférez les inserts dans une nouvelle plaque de 24 puits et immergez-les en pipetant doucement deux millilitres de solution d'extrait dans chaque insert.

Le niveau montera au-dessus des bords supérieurs de l'insert, recouvrant ainsi complètement les tissus des deux côtés. Scellez la plaque 24 puits à l’aide d’un scelleur thermique ou de paraform pour empêcher l’extraction et l’évaporation. Notez l’heure de début de l’extraction sur la fiche de documentation des méthodes et effectuez l’extraction pendant au moins deux heures à température ambiante avec un agitation douce sur un agitateur de plaque. Une fois la période d’extraction terminée, percez les inserts à l’aide d’une aiguille d’injection ou d’une pipette à embout caoutchouc et laissez l’extrait s’écouler dans le puits d’où l’insert a été prélevé.

Jetez les inserts perforés et pipetez la solution dans le puits trois fois vers le haut et vers le bas jusqu'à ce qu'elle soit homogène. Un agitateur de plaque réglé à 120 tr/min peut également être utilisé pour chaque tissu. Transférez deux aliquots de 200 microlitres de la solution au formazan bleu dans une microplaque de 96 puits à fond plat.

Transférez les duplicatas selon le schéma fixe de la plaque indiqué dans le tableau accompagnant ce protocole vidéo pour les témoins. Utilisez de l'isopropanol, mesurez la densité optique (DO) à l’aide d’un spectrophotomètre pour plaque de 96 puits, à une longueur d’onde de 570 nanomètres, sans filtre de référence. Saisissez les résultats dans le tableau pour un calcul automatique des résultats.

Prendre en compte les corrections dues aux interférences du produit chimique testé comme indiqué dans le protocole accompagnant ; un produit chimique testé est classé comme irritant. Si le pourcentage de viabilité tissulaire est inférieur ou égal à 50 % après analyse spectro-photométrique, que l'OD à 570 nm des tissus du contrôle négatif (NC) est supérieure ou égale à 1 et inférieure ou égale à 2,5, que la viabilité moyenne des tissus du contrôle positif (PC), exprimée en pourcentage par rapport aux tissus du contrôle négatif, est inférieure à 20 %, et que l'écart-type (SD) calculé à partir des viabilités tissulaires individuelles exprimées en pourcentage pour trois réplicats identiquement traités est inférieur à 18 %, alors les composés dont les valeurs de viabilité cellulaire sont inférieures à 50 % peuvent être considérés comme des irritants.

Nous venons de vous montrer comment réaliser le test validé d'irritation cutanée de 60 minutes et 42 heures à l'aide du modèle de peau humaine reconstituée Epiderm. Lors de l'exécution de cette procédure, il est important de se rappeler qu'une grande partie du test est effectuée en conditions stériles ou aussi aseptiques que possible. Si vous devez modifier la méthode ou si vous avez besoin d'une explication plus détaillée concernant une des étapes de la procédure, n'hésitez pas à nous contacter pour obtenir de l'aide et des conseils.

Voilà, c'est tout. Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.