Fluorescence In situ (FISH) du Protocole dans le sperme humain

Le protocole d'hybridation in situ en fluorescence dans les noyaux de spermatozoïdes humains a été largement intégré dans le domaine du diagnostic clinique. L'une des applications de cette méthodologie est le dépistage de la ploïdie des spermatozoïdes. Dans le cadre des conseils en matière de reproduction donnés aux hommes infertiles, la présence d'anomalies numériques est plus fréquente chez ces individus que dans la population générale, et ils présentent souvent des paramètres séminaux anormaux.

Cela représente un risque accru de transmission de ces anomalies à la descendance. Aujourd'hui, nous allons illustrer le protocole d'hybridation in situ en fluorescence sur des noyaux spermatozoïdes décondensés pour l'analyse des chromosomes 13, 18, 21, X et Y. Une fois l'échantillon prélevé, il doit être laissé à température ambiante pendant 20 minutes jusqu'à ce que la liquéfaction se produise. Pour commencer le protocole, l'échantillon doit être transféré dans un tube de centrifugeuse.

Les solutions que nous allons utiliser dans la première partie de l'expérience sont de l'hypertonique préchauffée à 37 degrés C et de l'acide acétique méthanolé dans une proportion de trois pour un. Ces solutions doivent être préparées fraîchement. Ensuite, l'échantillon est prêt à être centrifugé à mille G pendant cinq minutes.

Maintenant, retirez délicatement le surnageant et ajoutez la solution hypertonique goutte à goutte jusqu'à obtenir un volume d'environ 10 millilitres. Ce tube doit rester à 37 degrés C pendant 30 minutes, puis l'échantillon doit être à nouveau centrifugé. La centrifugation provoque l'accumulation des spermatozoïdes au fond du tube, ce qui nous permet de remplacer la solution hypotonique par le méthanol.

La centrifugation à l'acide acétique doit être répétée pour changer l'acide acétique méthanolé autant de fois que nécessaire afin d'obtenir un culot blanc. Lorsque cela se produit, il faut ajouter davantage d'acide acétique méthanolé. Le volume final doit être ajusté en fonction de la dispersion cellulaire que vous souhaitez obtenir lors des étapes ultérieures.

La dernière étape consiste à réaliser les étalages en déposant l'échantillon fixé sur des lames Reed conservées dans du méthanol à moins 20 degrés C. Il est utile de délimiter la zone de la lame contenant l'étalage de spermatozoïdes pour les analyses de localisation ultérieures. Cette délimitation peut facilement être effectuée à l'aide d'un crayon à pointe en diamant sur l'autre face de la lame. Une fois qu'une dispersion cellulaire optimale a été vérifiée, les lames doivent être conservées à moins 20 degrés C pendant au moins 24 heures.

Avant de poursuivre avec le protocole. Dans cette partie de l'expérience, nous allons utiliser une solution saline au citrate de sodium, une série d'éthanol, DRE, fatal et fide. Une fois que les lames ont été décongelées, les échantillons fixés doivent être lavés et déshydratés en les immergeant dans deux bocaux coplan successifs contenant deux fois SSC.

Cela prendra trois minutes pour chaque bain d'alcool. Ensuite, les lames doivent être immergées deux minutes dans chaque bain d'éthanol, par ordre de concentration croissante. À ce stade, afin de poursuivre les étapes suivantes, les lames doivent être séchées.

Étant donné que l'ADN présent dans le noyau du spermatozoïde est fortement compacté, il est nécessaire de décondenser la chromatine avant de la dénaturer. Cette étape peut être réalisée à l'aide d'une solution de DTT à 37 degrés C. Ce produit agit en rompant les ponts disulfure des protamines qui enroulent l'ADN dans le noyau des spermatozoïdes. Le temps d'incubation de la lame dans le DTT doit être ajusté en fonction de la réactivité de l'échantillon de sperme à ce produit.

En général, cela dure environ huit minutes, bien que cela puisse varier de deux à quinze minutes ; après ce délai, les lames doivent être transférées immédiatement dans du SSC 2× pendant trois minutes, puis à nouveau pendant trois minutes supplémentaires, suivies de deux minutes dans chacun des bains d'éthanol. Pour l'hybridation de la sonde, il est essentiel de travailler avec des brins simples d'ADN. Cela nécessite une étape de dénaturation avant l'ajout des sondes, impliquant une période d'incubation de cinq minutes dans une solution de formamide à 73 degrés C. Pour terminer le traitement des lames, un transfert final dans la solution d'éthanol est requis, en immergeant les lames pendant une minute par bain d'éthanol.

Les lames sont ensuite prêtes à être hybridées dans les études FISH réalisées à des fins de diagnostic clinique. Les chromosomes les plus fréquemment analysés incluent les chromosomes sexuels ainsi que les chromosomes 13, 18 et 21. Pour analyser ces chromosomes, nous utiliserons un kit multicolore de sondes d'ADN de vices.

Ceci contient un flacon avec une combinaison de sondes pour la région du satellite alpha des chromosomes X, Y et 18, marqués respectivement en vert d'origine et en aqua, et un autre flacon avec une combinaison de sondes pour les chromosomes 13 et 21, marquées respectivement en vert et en orange. Le volume du mélange de sondes ajouté variera selon la taille de la zone que vous souhaitez hybridée, en référence à une lame de couverture de 15 par 15. Un volume de cinq microlitres est suffisant.

Les deux mélanges de sondes sont pré-dénaturés dans un tampon d'hybridation pour faciliter leur utilisation, ce qui permet de les ajouter directement sur les lames décondensées et dénaturées. D'autres sondes commerciales sont également disponibles pour un large éventail de chromosomes et de Loki, et peuvent être utilisées dans ces expériences. En général, toutefois, ces sondes nécessitent un traitement de pré-dénaturation avant l'ajout du mélange à l'échantillon cible.

Dans ces situations, il suffit de suivre les instructions du fabricant. La région ciblée doit être recouverte d'une lamelle et scellée avec du ciment en caoutchouc. Ensuite, les lames sont prêtes à être placées dans la chambre d'hybridation, préalablement réchauffée à 37 degrés C, et incubées à cette température pendant six à 24 heures.

Dans la dernière partie du protocole, nous allons utiliser ces deux solutions de lavage composées de concentrations différentes de solution de citrate de sodium salin et du détergent NP 40. Après le temps d'incubation, les lames peuvent être retirées de la chambre d'hybridation afin d'éliminer le ciment caoutchouté. Puis on retire soigneusement la lame à couvrir.

Comme indiqué, les lames sont immergées deux minutes dans la première solution de lavage, préchauffée à 73 degrés C. Ensuite, elles sont transférées dans la seconde solution de lavage à température ambiante pendant une minute supplémentaire. Ces deux lavages nous aideront à éliminer tous les signaux d'hybridation non spécifiques. Après ces deux lavages, nous devons attendre que les lames sèchent pour conclure la dernière étape du protocole.

À ce stade, un produit de contre-coloration est ajouté pour faciliter la visualisation du noyau des cellules. L'un des produits les plus couramment utilisés à cet effet est le dpi. Le volume ajouté doit également être ajusté en fonction de la taille de la zone hybridée, en prenant comme référence une lame de couverture de 18 par 18.

Un volume de huit microlitres de DPI est suffisant. La lame couvre-objet peut être scellée avec du vernis à ongles, et les préparations sont alors prêtes à être visualisées. Sinon, elles peuvent être conservées à moins 20 degrés C jusqu'à leur analyse ultérieure.

Le microscope que nous allons utiliser pour la visualisation est un microscope à fluorescence épiscopique Olympus BX 60 équipé d'un filtre triple bande pour dpi, Texas Red, FITC, ainsi que de filtres simples bande pour aqua FITC et Texas Red. Grâce au filtre triple bande, la préparation hybridée avec x, Y et 18 affiche des signaux pour ces trois chromosomes. En utilisant le filtre simple bande pour aqua, nous pouvons uniquement visualiser les signaux fluorescents du chromosome 18. Nous devrions observer un de ces signaux dans chaque spermatozoïde normal.

Cependant, lorsqu'on utilise le filtre à bande unique pour la FITC uniquement, certains spermatozoïdes présentent un signal fluorescent vert correspondant au chromosome X. Les spermatozoïdes qui ne présentent pas de signal vert devraient afficher un signal rouge pour le chromosome Y, qui peut être spécifiquement visualisé à l'aide du filtre pour le Texas red. En visualisant l'hybridation 1321 à travers le filtre à triple bande, nous pouvons distinguer les signaux de ces deux chromosomes.

Le signal vert correspond au chromosome 13 et peut être spécifiquement visualisé à l’aide du filtre à bande unique pour la FITC. Le filtre à bande unique pour le Texas Red nous permet de visualiser spécifiquement les signaux du chromosome 21. Tous les spermatozoïdes normaux doivent présenter un signal pour chacun de ces deux sondes.

Pour résumer, voici les principales étapes du protocole. Encore une fois, le processus de fixation doit être soigneusement réalisé afin d'obtenir des préparations de bonne qualité, avec une addition goutte à goutte d'acide méthanoïque acétique. Pour éviter la formation d'agrégats de spermatozoïdes lors du processus de décondensation, le temps d'incubation dans la solution de DTT doit être ajusté en fonction de la réactivité de l'échantillon de sperme à ce produit.

Une exposition excessive des spermatozoïdes au DTT entraînerait des signaux dispersés à la fin du protocole, tandis qu'une exposition insuffisante entraînerait une hybridation nulle de la sonde et l'absence de certains signaux. Bien que la dénaturation de l'échantillon de spermatozoïdes soit obligatoire, la dénaturation de la sonde doit être adaptée aux indications du fabricant. Il est important de contrôler rigoureusement la durée et la température des deux lavages post-hybridation.

Une température plus élevée ou une durée de lavage excessive peut entraîner l'élimination de certains signaux, tandis que l'inverse n'éliminerait pas les signaux non spécifiques. Enfin, l'utilisation d'un microscope à fluorescence épiscopique équipé de filtres spécifiques adéquats est essentielle pour une bonne visualisation et l'interprétation des signaux. Et voilà.

Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.