Name: Fluorescence In situ (FISH) du Protocole dans le sperme humain (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-09-01T11:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 19 s
Description: Apprenez la technique FISH pour analyser les spermatozoïdes humains et dépister les aneuploïdies chromosomiques 13, 18, 21, X et Y. Cette méthode clinique évalue les risques de transmission génétique chez les hommes infertiles.

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Ce travail a été soutenu par la Generalitat de Catalunya (2005-SGR00437). Les auteurs remercient J. Blanco et F. Vidal pour leur supervision et d&#39;encouragement, et J. Lucas pour son assistance technique.

Le traitement des échantillons et la fixation des cellules I. <ol><li> Laisser l&#39;échantillon de sperme dans des contenants stériles à température ambiante pendant 20 minutes jusqu&#39;à liquéfaction. </li><li> Transférer l&#39;échantillon dans un tube de centrifugeuse et il tourne à 1000g pendant 5 minutes. </li><li> Retirer délicatement et jeter le surnageant à l&#39;aide d&#39;une pipette Pasteur. </li><li> Ajouter une solution hypotonique (KCl, 0,075 M) pré-chauffé à 37 ° C, goutte à goutte, tout en mélangeant sur un vortex pour obtenir un volume final de 10 ml. </li><li> Placer le tube dans un bain d&#39;eau à 37 ° C pendant 30 minutes. </li><li> Centrifuger à 1000g pendant 5 minutes. Soigneusement jeter le surnageant par décantation, sans perturber le culot. </li><li> Après remise en suspension du culot, ajouter fraîchement préparés fixateur de Carnoy (méthanol 03h01: acide acétique) goutte à goutte tout en mélangeant sur un vortex d&#39;obtenir un volume final de 8 ml. </li><li> Répéter les points 6 et 7 autant de fois que nécessaire pour obtenir une pastille blanche. </li><li> Ajouter méthanol fraîchement préparés: acide acétique (3:1) goutte à goutte pour ajuster le volume final à la concentration cellulaire nécessaire à l&#39;obtention de cellules bonne répartition (dans ces cas avec une petite pastille, quelques gouttes suffiront alors que les échantillons avec une grande quantité des spermatozoïdes récupérés, le volume final peut atteindre 1-2 ml). Une lame de test peut être fait en laissant tomber l&#39;échantillon en suspension sur une lame non graissée et de l&#39;examiner sous un microscope à contraste de phase. Cela vous permettra de vérifier la dispersion cellulaire obtenue et lui permettrait de corriger, s&#39;il est nécessaire, dans les diapositives supplémentaires. </li><li> Pour faire les extensions, chute d&#39;une hauteur minimale de 40 cm à deux ou trois gouttes de suspension cellulaire dans le centre de glisse non glacés (précédemment stockées dans le méthanol à -20 ° C pour les dégraisser). Afin de permettre la localisation de l&#39;échantillon tout au long du protocole, de marquer la zone contenant l&#39;extension du sperme sur le côté opposé de la lame à l&#39;aide d&#39;un crayon de diamant. </li><li> Stocker les diapositives à -20 ° C pendant au moins 24 heures. Remarque: L&#39;ajout de méthanol: acide acétique (3:1) goutte à goutte tout en mélangeant une étape très importante pour éviter la formation d&#39;agrégats de sperme. </li></ol> II. Décondensation <ol><li> Les diapositives stockées à -20 ° C doit être dégivré pour continuer avec le protocole (les laisser à température ambiante). </li><li> Placer la lame dans deux jarres Coplin consécutifs avec une solution de citrate de sodium salin 2x (2xSSC) pendant 3 minutes chacune. </li><li> Transférer le glisser à travers une série de lavages éthanol pendant 2 minutes dans chaque jarre de Coplin. Commencez avec 70% d&#39;éthanol, suivi par 90% et terminer avec 100%. Déshydrater la glisser le laissant à température ambiante. </li><li> Incuber la lame dans une solution de dithiothréitol (1,4-dithiothréitol 5mM, 1% de Triton X-100, 2-amino-2-(hydroxyméthyl) -1,3-propanediol 50mm) à 37 ° C dans l&#39;incubateur à decondense la chromatine. Ce produit agit en brisant les ponts disulfures de la protamines que la bobine de l&#39;ADN dans le noyau des spermatozoïdes. C&#39;est une étape très importante car l&#39;ADN dans le noyau du spermatozoïde est très compacté. Le temps d&#39;incubation des lames dans une solution de dithiothréitol (DTT) doit être ajustée en fonction de la réactivité de l&#39;échantillon de ce produit. Habituellement, ce temps est d&#39;environ 8 minutes, mais il peut varier de 2 à 15 minutes. </li><li> Immédiatement, le transfert de la diapositive à deux mandats consécutifs de jarres Coplin avec 2xSSC pendant 3 minutes dans chaque Coplin. </li><li> Continuer en plaçant la lame à travers une série de lavages éthanol pendant 2 minutes dans chaque jarre de Coplin (70%, 90% et 100% d&#39;éthanol). Laissez la lame sécher à température ambiante. Remarque: Une exposition excessive à la TNT entraînerait dispersent signaux FISH à la fin de la procédure, alors qu&#39;une exposition trop courte donnerait lieu à un manque de certains signaux. </li></ol> III. Hybridation <ol><li> Dénaturer l&#39;ADN des spermatozoïdes en incubant la lame dans un bocal avec une solution de formamide Coplin (70% Formamide/2xSSC) à 73 ° C pendant 5 minutes. </li><li> Transfert de la diapositive à travers des solutions d&#39;éthanol pour 1 minute par Coplin jar (commencer avec 70% d&#39;éthanol, 85% et terminer avec 100%). Laisser la lame sécher à température ambiante. </li><li> Ajouter directement 5 l de l&#39;correspondante de prêt-à-utiliser un mélange de sonde d&#39;une lamelle 15x15 (Assay AneuVysion Sonde Panneau multi-couleurs: CEP 18/X/Y ou LSI 13/21). </li><li> Comme il est montré dans la vidéo, placer soigneusement la glisser sur la lamelle de mettre sur pied la région cible et le mélange de la sonde. Scellez avec du ciment en caoutchouc. </li><li> Placer la lame dans un 37 pré-chauffé ° C chambre d&#39;hybridation (HYBrite ™) et incuber à 37 ° C pendant 6-24 heures. Remarque: Alors que la dénaturation de l&#39;échantillon de sperme est obligatoire, la nécessité de dénaturation des sondes est déterminé par le fabricant. Les mélanges sonde utilisée dans ce protocole sont prêts à utiliser et, dans ce cas, la dénaturation de sonde n&#39;est pas nécessaire. Le volume du mélange de sondes varie en fonction de la taille de la zone hybride. </li></ol> IV. Lavepost-hybridation <ol><li> Sortez la lame de la chambre d&#39;hybridation. </li><li> Enlever la colle au caoutchouc et tirez délicatement sur la lamelle glissant doucement sur le côté. </li><li> Afin d&#39;éliminer les signaux d&#39;hybridation non spécifiques placer la lame pendant 2 minutes dans une jarre de Coplin avec 0.4xSSC/0.3% NP-40 pré-chauffé à 73 ° C dans un bain d&#39;eau. </li><li> Transfert de la diapositive à une solution 2xSSC/0.1% NP-40 lavage à température ambiante pendant 1 minute. Laissez la lame sécher à température ambiante. </li><li> Ajouter un produit contre-coloration à la région cible (8 l pour une lamelle de 18x18). Le produit le plus couramment utilisé est de 4 &#39;,6-diamidino-2-phénylindole (DAPI, Vysis Inc.) </li><li> Comme il est montré dans la vidéo, la couverture de la région hybridée avec une lamelle (pour préserver l&#39;hybridation de la lamelle peut être scellé avec du vernis à ongles). </li><li> Stocker les lames hybridées à -20 ° C dans l&#39;obscurité jusqu&#39;à leur analyse perspective. Dans ces conditions, les diapositives peuvent être stockées pendant 12 mois sans perte vraiment importante dans l&#39;intensité du signal de fluorescence. Remarque: Une température plus élevée ou un temps de lavage excessif peut entraîner l&#39;élimination de certains signaux, alors que l&#39;inverse ne serait pas laver la sonde hybridations non spécifiques. Le volume du produit de contre-coloration ajoutée varie en fonction de la taille de la zone d&#39;hybridation pour la couverture. </li></ol> Visualisation V. Les préparations peuvent être évalués sous un microscope à épifluorescence équipé d&#39;un filtre à triple bande pour DAPI / Texas Red / FITC et simples filtres à bande pour Aqua, FITC et au Texas Red. Critères d&#39;évaluation standard doivent être suivies pour l&#39;évaluation correcte des noyaux 1 sperme. La préparation hybridé avec des sondes pour les chromosomes X, Y et 18 devraient afficher des signaux de ces trois chromosomes. Chaque spermatozoïde normal doit montrer un signal bleu (correspondant au chromosome 18), et un signal vert (X portant spermatozoïdes) ou un signal rouge (Y portant spermatozoïdes). Dans la préparation hybridé avec des sondes pour les chromosomes 13 et 21, un signal vert pour le chromosome 13 et un signal rouge pour le chromosome 21 doit être distingué dans tous les spermatozoïdes normaux.

<ol><li>Blanco, J., Egozcue, J., Vidal, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incidence+of+chromosome+21+disomy+in+human+spermatozoa+as+determined+by+fluorescent+in-situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Reprod%22%5BJournal%5D)">Incidence of chromosome 21 disomy in human spermatozoa as determined by fluorescent in-situ hybridization.</a> Hum. Reprod. 11, 722-726 (1996).</li>
</ol>

Les auteurs n'ont rien à divulguer.

Ce protocole décrit comment traiter les échantillons de sperme de l&#39;homme pour obtenir les préparations de poisson sperme. L&#39;utilisation de ce protocole, il est possible d&#39;analyser des anomalies chromosomiques dans les gamètes mâles. Les spermatozoïdes aneuploïdie de dépistage a des applications soit dans le contexte de la recherche fondamentale et dans les conseils de reproduction donnée aux hommes infertiles. Bien que dans le diagnostic clinique des chromosomes les plus étudiées sont X, Y, 13, 18 et 21, d&...

<table><tbody><tr><td>1,4-dithiothréitol (DTT)</td><td>Matériel</td><td>Roche Group</td><td>10197777001</td><td></td></tr><tr><td>2-Amino-2-(hydroxyméthyl)-1,3-propanediol</td><td>Matériel</td><td>Groupe Roche</td><td>10708976001</td><td></td></tr><tr><td>Acide acétique</td><td>Matériel</td><td>Merck &amp;amp; Co., Inc.</td><td>100.063</td><td></td></tr><tr><td>AneuVysion&amp;#174; Kit de sondes d'ADN multicolores&lt;ul style=&quot;remplissage : 2 px ;&quot;&gt;&lt;li&gt;20x Saline-citrate de sodium&lt;/li&gt;&lt;li&gt;4,6-diamidino-2-phénylindole (DAPI II)&lt;/li&gt;&lt;li&gt;sonde ADN CEP 18/X/Y&lt;/li&gt;&lt;li&gt;NP-40&lt;/li&gt;&lt;li&gt;sonde ADN LSI 13/21&lt;/li&gt;&lt;/ul&gt;</td><td>Matériel</td><td>Vysis Inc.</td><td>32-161075 &lt;ul style=&quot;remplissage : 2 px ;&quot;&gt;&lt;li&gt;30-805850&lt;/li&gt;&lt;li&gt;30-804941 &lt;/li&gt;&lt;li&gt;30-171077&lt;/li&gt;&lt;li&gt;30-804820&lt;/li&gt;&lt;li&gt;30-171078&lt;/li&gt;&lt;/ul&gt;</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeuse 5804R</td><td>Outil</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tube à centrifuger</td><td>Matériel</td><td>Nalge Nunc international</td><td>347856</td><td></td></tr><tr><td>bocal de Coplin (verre)</td><td>Matériel</td><td>Barloworld Scientific</td><td>Hellendahl (ZCT278)</td><td></td></tr><tr><td>bocal de Coplin (plastique)</td><td>Matériel</td><td>Deltalab</td><td>191087</td><td></td></tr><tr><td>Coverslips (15x15)</td><td>Matériel</td><td>Knittel Glaser</td><td>4600115</td><td></td></tr><tr><td>Coverslips (18x18)</td><td>Matériel</td><td>Knittel Glaser</td><td>4600118</td><td></td></tr><tr><td>Crayon diamant</td><td>Matériel</td><td>Hammacher</td><td>335117010</td><td></td></tr><tr><td>Éthanol</td><td>Matériel</td><td>Merck &amp;& Cie, Inc.</td><td>100.983</td><td></td></tr><tr><td>Formamide</td><td>Matériel</td><td>Roche Group</td><td>11814320001</td><td></td></tr><tr><td>Congélateur</td><td>Outil</td><td>Zanussi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gants</td><td>Matériel</td><td>Sanyo</td><td>101/3300</td><td></td></tr><tr><td>HYBrite&amp;#8482;</td><td>Outil</td><td>Vysis Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Huile à immersion</td><td>Matériel</td><td>Olympus Corporation</td><td>35505</td><td></td></tr><tr><td>Incubateur</td><td>Outil</td><td>Heraeus Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Méthanol</td><td>Matériel</td><td>Merck &amp;& Cie, Inc.</td><td>106.009</td><td></td></tr><tr><td>Micropipette</td><td>Matériel</td><td>Labsystems</td><td>Finnpipette (4500000)</td><td></td></tr><tr><td>Embouts jetables pour micropipette</td><td>Matériel</td><td>Daslab</td><td>16-2001</td><td></td></tr><tr><td>Vernis à ongles</td><td>Matériel</td><td>Quo-cosmétiques</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscope à épifluorescence Olympus BX60</td><td>Outil</td><td>Olympus Corporation</td><td></td><td>Équipé d'un filtre triple bande pour DAPI/Texas Red/FITC et de filtres mono-bande pour Aqua, FITC et Texas Red.</td></tr><tr><td>Pipette Pasteur</td><td>Matériel</td><td>Rubilabor</td><td>211.0230</td><td></td></tr><tr><td>Microscope à contraste de phase</td><td>Outil</td><td>Nikon Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipette en plastique (3 ml)</td><td>Matériel</td><td>Deltalab</td><td>200007</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de potassium (KCl)</td><td>Matériel</td><td>Fluka</td><td>60128</td><td></td></tr><tr><td>Ciment caoutchouc</td><td>Matériel</td><td>Meilleur test</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lames porte-lames</td><td>Matériel</td><td>Knittel Glaser</td><td>4520022</td><td></td></tr><tr><td>Boîtes de protection pour lames</td><td>Matériel</td><td>Deltalab</td><td>19276.1</td><td></td></tr><tr><td>Récipient stérile</td><td>Matériel</td><td>Deltalab</td><td>409726</td><td></td></tr><tr><td>Seringue</td><td>Matériel</td><td>PentaFerte</td><td>002022300</td><td></td></tr><tr><td>Thermomètre</td><td>Matériel</td><td>Comark Instruments, Inc</td><td>KM12</td><td></td></tr><tr><td>Eau tri-destillée</td><td>Matériel</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Matériel</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9002-93-1</td><td></td></tr><tr><td>Pinces</td><td>Matériel</td><td>B. Braun Medical</td><td>Aesculap (BD224R)</td><td></td></tr><tr><td>Laminaire vertical &lt;em&gt;hotte à flux laminaire&lt;/em&gt;</td><td>Outil</td><td>Burdinola</td><td>OR-ST 1500</td><td></td></tr><tr><td>Agitateur vortex</td><td>Outil</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB15012</td><td></td></tr><tr><td>Bain-marie</td><td>Outil</td><td>Raypa&amp;#174;</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

fluorescence in situ</eml&#39;hybridation> (fish) du protocole dans le sperme humain

Fluorescence in situ hybridization (FISH) Protocol in Human Sperm

Aneuploïdies sont les anomalies les plus fréquentes chromosomiques chez l&#39;homme. La plupart de ces anomalies résultent d&#39;erreurs durant le processus de la méiose gamétogènes chez les parents. Dans les mâles humains, ces erreurs peuvent conduire à la production de spermatozoïdes avec des anomalies chromosomiques numériques qui représentent un risque accru de transmission de ces anomalies à la descendance. Pour cette raison, la technique de l&#39;hybridation fluorescente in situ (FISH) sur noyaux de spermatozoïdes est devenu un protocole largement intégrées dans le contexte du diagnostic clinique. Cette pratique donne une estimation de la fréquence des anomalies chromosomiques numériques dans les gamètes des patients qui cherchent des conseils de reproduction génétique. À ce jour, les chromosomes les plus fréquemment inclus dans l&#39;analyse FISH des spermatozoïdes sont les chromosomes X, Y, 13, 18 et 21. Cette vidéo-article décrit, étape par étape, comment traiter et résoudre un échantillon de sperme humain, comment decondense et dénaturer la chromatine des spermatozoïdes, la façon de procéder pour obtenir les préparations de poisson du sperme, et la façon de visualiser les résultats au microscope. Remarque spéciale sur les étapes les plus pertinents sont donnés pour atteindre les meilleurs résultats.

Cette vidéo-article décrit, étape par étape, comment traiter un échantillon de sperme d&#39;atteindre une bonne qualité de fluorescence<em&gt; In situ</emL&#39;hybridation&gt; sur les spermatozoïdes humains. Préparations obtenues peuvent être utilisées pour le dépistage d&#39;aneuploïdie dans le contexte du diagnostic clinique.

Fluorescence In situ</emL&#39;hybridation> (FISH) du Protocole dans le sperme humain

Les aneuploïdies sont les anomalies chromosomiques les plus fréquentes chez l'être humain. La plupart de ces anomalies résultent d'erreurs méiotiques survenant lors de la gamétogenèse...

Le protocole d'hybridation in situ en fluorescence dans les noyaux de spermatozoïdes humains a été largement intégré dans le domaine du diagnostic clinique. L'une des applications de cette méthodologie est le dépistage de la ploïdie des spermatozoïdes. Dans le cadre des conseils en matière de reproduction donnés aux hommes infertiles, la présence d'anomalies numériques est plus fréquente chez ces individus que dans la population générale, et ils présentent souvent des paramètres séminaux anormaux.Cela représente un risque accru de transmission de ces anomalies à la descendance. Aujourd'hui, nous allons illustrer le protocole d'hybridation in situ en fluorescence sur des noyaux spermatozoïdes décondensés pour l'analyse des chromosomes 13, 18, 21, X et Y. Une fois l'échantillon prélevé, il doit être laissé à température ambiante pendant 20 minutes jusqu'à ce que la liquéfaction se produise. Pour commencer le protocole, l'échantillon doit être transféré dans un tube de centrifugeuse.Les solutions que nous allons utiliser dans la première partie de l'expérience sont de l'hypertonique préchauffée à 37 degrés C et de l'acide acétique méthanolé dans une proportion de trois pour un. Ces solutions doivent être préparées fraîchement. Ensuite, l'échantillon est prêt à être centrifugé à mille G pendant cinq minutes.Maintenant, retirez délicatement le surnageant et ajoutez la solution hypertonique goutte à goutte jusqu'à obtenir un volume d'environ 10 millilitres. Ce tube doit rester à 37 degrés C pendant 30 minutes, puis l'échantillon doit être à nouveau centrifugé. La centrifugation provoque l'accumulation des spermatozoïdes au fond du tube, ce qui nous permet de remplacer la solution hypotonique par le méthanol.La centrifugation à l'acide acétique doit être répétée pour changer l'acide acétique méthanolé autant de fois que nécessaire afin d'obtenir un culot blanc. Lorsque cela se produit, il faut ajouter davantage d'acide acétique méthanolé. Le volume final doit être ajusté en fonction de la dispersion cellulaire que vous souhaitez obtenir lors des étapes ultérieures.La dernière étape consiste à réaliser les étalages en déposant l'échantillon fixé sur des lames Reed conservées dans du méthanol à moins 20 degrés C. Il est utile de délimiter la zone de la lame contenant l'étalage de spermatozoïdes pour les analyses de localisation ultérieures. Cette délimitation peut facilement être effectuée à l'aide d'un crayon à pointe en diamant sur l'autre face de la lame. Une fois qu'une dispersion cellulaire optimale a été vérifiée, les lames doivent être conservées à moins 20 degrés C pendant au moins 24 heures.Avant de poursuivre avec le protocole. Dans cette partie de l'expérience, nous allons utiliser une solution saline au citrate de sodium, une série d'éthanol, DRE, fatal et fide. Une fois que les lames ont été décongelées, les échantillons fixés doivent être lavés et déshydratés en les immergeant dans deux bocaux coplan successifs contenant deux fois SSC.Cela prendra trois minutes pour chaque bain d'alcool. Ensuite, les lames doivent être immergées deux minutes dans chaque bain d'éthanol, par ordre de concentration croissante. À ce stade, afin de poursuivre les étapes suivantes, les lames doivent être séchées.Étant donné que l'ADN présent dans le noyau du spermatozoïde est fortement compacté, il est nécessaire de décondenser la chromatine avant de la dénaturer. Cette étape peut être réalisée à l'aide d'une solution de DTT à 37 degrés C. Ce produit agit en rompant les ponts disulfure des protamines qui enroulent l'ADN dans le noyau des spermatozoïdes. Le temps d'incubation de la lame dans le DTT doit être ajusté en fonction de la réactivité de l'échantillon de sperme à ce produit.En général, cela dure environ huit minutes, bien que cela puisse varier de deux à quinze minutes ; après ce délai, les lames doivent être transférées immédiatement dans du SSC 2× pendant trois minutes, puis à nouveau pendant trois minutes supplémentaires, suivies de deux minutes dans chacun des bains d'éthanol. Pour l'hybridation de la sonde, il est essentiel de travailler avec des brins simples d'ADN. Cela nécessite une étape de dénaturation avant l'ajout des sondes, impliquant une période d'incubation de cinq minutes dans une solution de formamide à 73 degrés C. Pour terminer le traitement des lames, un transfert final dans la solution d'éthanol est requis, en immergeant les lames pendant une minute par bain d'éthanol.Les lames sont ensuite prêtes à être hybridées dans les études FISH réalisées à des fins de diagnostic clinique. Les chromosomes les plus fréquemment analysés incluent les chromosomes sexuels ainsi que les chromosomes 13, 18 et 21. Pour analyser ces chromosomes, nous utiliserons un kit multicolore de sondes d'ADN de vices.Ceci contient un flacon avec une combinaison de sondes pour la région du satellite alpha des chromosomes X, Y et 18, marqués respectivement en vert d'origine et en aqua, et un autre flacon avec une combinaison de sondes pour les chromosomes 13 et 21, marquées respectivement en vert et en orange. Le volume du mélange de sondes ajouté variera selon la taille de la zone que vous souhaitez hybridée, en référence à une lame de couverture de 15 par 15. Un volume de cinq microlitres est suffisant.Les deux mélanges de sondes sont pré-dénaturés dans un tampon d'hybridation pour faciliter leur utilisation, ce qui permet de les ajouter directement sur les lames décondensées et dénaturées. D'autres sondes commerciales sont également disponibles pour un large éventail de chromosomes et de Loki, et peuvent être utilisées dans ces expériences. En général, toutefois, ces sondes nécessitent un traitement de pré-dénaturation avant l'ajout du mélange à l'échantillon cible.Dans ces situations, il suffit de suivre les instructions du fabricant. La région ciblée doit être recouverte d'une lamelle et scellée avec du ciment en caoutchouc. Ensuite, les lames sont prêtes à être placées dans la chambre d'hybridation, préalablement réchauffée à 37 degrés C, et incubées à cette température pendant six à 24 heures.Dans la dernière partie du protocole, nous allons utiliser ces deux solutions de lavage composées de concentrations différentes de solution de citrate de sodium salin et du détergent NP 40. Après le temps d'incubation, les lames peuvent être retirées de la chambre d'hybridation afin d'éliminer le ciment caoutchouté. Puis on retire soigneusement la lame à couvrir.Comme indiqué, les lames sont immergées deux minutes dans la première solution de lavage, préchauffée à 73 degrés C. Ensuite, elles sont transférées dans la seconde solution de lavage à température ambiante pendant une minute supplémentaire. Ces deux lavages nous aideront à éliminer tous les signaux d'hybridation non spécifiques. Après ces deux lavages, nous devons attendre que les lames sèchent pour conclure la dernière étape du protocole.À ce stade, un produit de contre-coloration est ajouté pour faciliter la visualisation du noyau des cellules. L'un des produits les plus couramment utilisés à cet effet est le dpi. Le volume ajouté doit également être ajusté en fonction de la taille de la zone hybridée, en prenant comme référence une lame de couverture de 18 par 18.Un volume de huit microlitres de DPI est suffisant. La lame couvre-objet peut être scellée avec du vernis à ongles, et les préparations sont alors prêtes à être visualisées. Sinon, elles peuvent être conservées à moins 20 degrés C jusqu'à leur analyse ultérieure.Le microscope que nous allons utiliser pour la visualisation est un microscope à fluorescence épiscopique Olympus BX 60 équipé d'un filtre triple bande pour dpi, Texas Red, FITC, ainsi que de filtres simples bande pour aqua FITC et Texas Red. Grâce au filtre triple bande, la préparation hybridée avec x, Y et 18 affiche des signaux pour ces trois chromosomes. En utilisant le filtre simple bande pour aqua, nous pouvons uniquement visualiser les signaux fluorescents du chromosome 18. Nous devrions observer un de ces signaux dans chaque spermatozoïde normal.Cependant, lorsqu'on utilise le filtre à bande unique pour la FITC uniquement, certains spermatozoïdes présentent un signal fluorescent vert correspondant au chromosome X. Les spermatozoïdes qui ne présentent pas de signal vert devraient afficher un signal rouge pour le chromosome Y, qui peut être spécifiquement visualisé à l'aide du filtre pour le Texas red. En visualisant l'hybridation 1321 à travers le filtre à triple bande, nous pouvons distinguer les signaux de ces deux chromosomes.Le signal vert correspond au chromosome 13 et peut être spécifiquement visualisé à l’aide du filtre à bande unique pour la FITC. Le filtre à bande unique pour le Texas Red nous permet de visualiser spécifiquement les signaux du chromosome 21. Tous les spermatozoïdes normaux doivent présenter un signal pour chacun de ces deux sondes.Pour résumer, voici les principales étapes du protocole. Encore une fois, le processus de fixation doit être soigneusement réalisé afin d'obtenir des préparations de bonne qualité, avec une addition goutte à goutte d'acide méthanoïque acétique. Pour éviter la formation d'agrégats de spermatozoïdes lors du processus de décondensation, le temps d'incubation dans la solution de DTT doit être ajusté en fonction de la réactivité de l'échantillon de sperme à ce produit.Une exposition excessive des spermatozoïdes au DTT entraînerait des signaux dispersés à la fin du protocole, tandis qu'une exposition insuffisante entraînerait une hybridation nulle de la sonde et l'absence de certains signaux. Bien que la dénaturation de l'échantillon de spermatozoïdes soit obligatoire, la dénaturation de la sonde doit être adaptée aux indications du fabricant. Il est important de contrôler rigoureusement la durée et la température des deux lavages post-hybridation.Une température plus élevée ou une durée de lavage excessive peut entraîner l'élimination de certains signaux, tandis que l'inverse n'éliminerait pas les signaux non spécifiques. Enfin, l'utilisation d'un microscope à fluorescence épiscopique équipé de filtres spécifiques adéquats est essentielle pour une bonne visualisation et l'interprétation des signaux. Et voilà.Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.

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Compte tenu de leur anatomie simple, les testicules d’anophèles offrent un bon modèle cytologique pour l’étude de la spermatogenèse. Ce protocole décrit l’hybridation in situ par fluorescence complète, une technique utilisée pour étudier ce processus biologique, ainsi que le phénotype des souches transgéniques présentant des mutations dans les gènes impliqués dans la production de spermatozoïdes.

Hybridation in situ par fluorescence complète pour étudier la spermatogenèse chez le moustique anophèle

Apprenez la technique FISH pour analyser les spermatozoïdes humains et dépister les aneuploïdies chromosomiques 13, 18, 21, X et Y. Cette méthode clinique évalue les risques de transmission génétique chez les hommes infertiles.

Fluorescence In situ (FISH) du Protocole dans le sperme humain

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