Name: Obtention hautement purifiée Toxoplasma gondii Les oocystes par un gradient de chlorure de césium discontinu (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-11-03T16:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 17 s
Description: Apprenez à purifier les oocystes de Toxoplasma gondii à haute pureté à l'aide d'un gradient discontinu de chlorure de césium. Cette méthode permet d'obtenir des parasites adaptés aux expériences de biologie moléculaire et de culture tissulaire.

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Nous tenons à remercier Nichole Brinkman et Michael Ware pour examen technique du manuscrit et le Dr Abu Sayed et Linda Ransick pour le soutien technique et administratif. L&#39;Agence américaine de protection de l&#39;environnement à travers son Bureau de Recherche et Développement partiellement financé et collaboré à la recherche décrite ici sous le contrat numéro EP-D-06-096 à Dynamac, Inc et un numéro d&#39;accord inter-DW-12-92289801-0 à l&#39;USDA. Il a été soumis à l&#39;examen de l&#39;Agence et approuvé pour publication. La mention de noms commerciaux ou de produits commerciaux ne constitue pas une approbation ou une recommandation d&#39;utilisation. MJS adresse actuelle: Dynamac, Inc Cincinnati, OH.

<p class="jove_title"&gt; 1. Précautions générales de sécurité quand on travaille avec<em&gt; T. gondii</em&gt; Oocystes</p&gt;<ol&gt;<li&gt; Il est important de suivre toutes les précautions de sécurité lorsque vous travaillez avec<em&gt; T. gondii</em&gt; Oocystes. Dans la plupart des individus sains,<em&gt; T. gondii</emInfection&gt; est facilement contrôlée par le système immunitaire, mais un résultat d&#39;infection long de la vie. Les personnes immunodéprimées sont particulièrement sensibles à la toxoplasmose et ne devraient pas manipuler<em&gt; T. gondii</em&gt; Oocystes. Les femmes enceintes devraient également pas manipuler<em&gt; T. gondii</em&gt; Oocystes, parce que l&#39;infection peut causer des malformations congénitales graves<sup&gt; 8</sup&gt;.</li&gt;<li<em&gt; T. gondii</em&gt; Oocystes ne doit être manipulé dans un endroit désigné et avec un personnel qualifié. Les panneaux indiquant<em&gt; T. gondii</em&gt; Oocyste travaux sont en cours doivent être affichés pour avertir les autres entrer dans la zone désignée.</li&gt;<li&gt; Porter un équipement de protection individuelle (EPI) comme un sarrau de laboratoire, une blouse jetable, des gants jetables et des lunettes de protection ou un écran facial lors de la manipulation<em&gt; T. gondii</em&gt; Oocystes.</li&gt;<liChangements&gt; fréquent de gants est recommandé. Ne pas manipuler un équipement de laboratoire avec<em&gt; T. gondii</em&gt; Oocyste contaminés gants.</li&gt;<li&gt; Toujours utiliser des plateaux métalliques autoclavables doublée d&#39;un doublures absorbant jetable lorsque vous travaillez avec<em&gt; T. gondii</em&gt; Oocystes. S&#39;assurer que tous les supports, tubes, etc utilisées sont jetables ou autoclavables.</li&gt;<li&gt; Tous les<em&gt; T. gondii</em&gt; Les déchets doivent être autoclavés à deux reprises pour au moins une heure.</li&gt;<li&gt; Tout le matériel non jetable (grilles, les plateaux, etc) doivent également être autoclavé à deux reprises pour au moins une heure.</li&gt;<liLignes à vide&gt; utilisée pour aspirer les liquides doivent être connectés à un Vacushield ™ filtre pour empêcher la contamination de la pompe à vide.</li&gt;<li&gt; Tous les laboratoires concernés banc-tops doivent être désinfectés après avoir terminé de travailler avec<em&gt; T. gondii</em&gt; Oocystes. Fraîchement fait l&#39;hypochlorite de 10% devrait être largement appliquée à la zone de travail et a permis à sec. La zone doit ensuite être bien rincé à l&#39;eau.</li&gt;</ol&gt;<p class="jove_title"&gt; 2. Préparation des tampons et des solutions</p&gt;<ol&gt;<li&gt; Préparer une solution à 1 L de 2,2 M de saccharose en dissolvant 752,66 g de saccharose dans 600 ml ddH<sub&gt; 2</sub&gt; O. Remuez et faites chauffer doucement en utilisant une plaque d&#39;agitation chauffée pour dissoudre le saccharose. Une fois complètement dissous, mettre le volume à 1 L avec ddH<sub&gt; 2</sub&gt; O. Ceci devrait être suivi d&#39;une stérilisation par autoclave la solution pendant au moins 20 minutes.</li&gt;<li&gt; Préparer un 1L tampon TE (50 mM Tris-HCl, EDTA 10 mM), pH 7,2 en ajoutant 6,05 g de Tris-HCl et 3,7 g d&#39;EDTA dans 700 ml de DDH<sub&gt; 2</sub&gt; O, ajuster le pH à 7,2 puis porter le volume à 1 L avec ddH<sub&gt; 2</sub&gt; O.</li&gt;<li&gt; Pour le gradient de CsCl, préparer une solution stock de CsCl avec une gravité spécifique de 1,15 (1,15-CsCl) en ajoutant 21,75 g de CsCl avec 103,25 ml de tampon TE. Pour la solution A, mélanger 30 ml de TE avec 20 ml de 1,15 CsCl. Pour la solution B, mélanger 20 ml de TE avec 30 ml de CsCl de 1,15 et 12,5 pi de solution de rouge de phénol. Pour la solution C, mélanger 10 ml de TE avec 40 ml de CsCl de 1,15 (tableau 1).</li&gt;<li&gt; Préparer un 1L solution 1 N d&#39;hydroxyde de sodium (NaOH) en dissolvant 40 g de NaOH dans 800 ml de DDH<sub&gt; 2</sub&gt; O. Une fois dissous, mettre le volume à 1 L avec ddH<sub&gt; 2</sub&gt; O.</li&gt;<li&gt; Préparer une solution à 1 L 2% (en volume) de H<sub&gt; 2</sub&gt; SO<sub&gt; 4</sub&gt; Mélanger 20 ml de H<sub&gt; 2</sub&gt; SO<sub&gt; 4</sub&gt; Avec 980 ml de DDH<sub&gt; 2</sub&gt; O.</li&gt;</ol&gt;<p class="jove_title"&gt; 3. Float Saccharose</p&gt;<ol&gt;<li&gt; Ajouter 10 ml d&#39;une suspension fécale des<em&gt; T. gondii</em&gt; Oocystes, dans 2% H<sub&gt; 2</sub&gt; SO<sub&gt; 4</sub&gt;, Dans un tube de 50 ml à centrifuger conique. Il faut noter que la suspension fécale se réfère à des échantillons qui ont été pré-traitées à travers une procédure de flottation du sucrose comme décrit précédemment<sup&gt; 8</sup&gt;. Lorsque les échantillons fécaux sont d&#39;abord récoltés par les chats infectés qu&#39;ils sont traitées par un flotteur de saccharose comme décrit dans la référence 8. Ce flotteur de saccharose supplémentaire est nécessaire pour minimiser encore les débris fécaux reporté sur le processus de purification de CsCl et d&#39;obtenir la plus pure<em&gt; T. gondii</em&gt; Oocystes possible.</li&gt;<li&gt; Neutraliser le H 2%<sub&gt; 2</sub&gt; SO<sub&gt; 4</sub&gt; En ajoutant 6 ml (3 / 5 volumes) de NaOH 1 N à la suspension fécale. Mélangez bien au vortex.</li&gt;<li&gt; Ajouter un volume égal (16 ml) de 2,2 M de saccharose créant une concentration finale de 1,1 M à la suspension fécale et bien mélanger au vortex.</li&gt;<li&gt; Soigneusement superposition du saccharose / suspension fécale avec 10 ml ddH<sub&gt; 2</sub&gt; S à l&#39;aide d&#39;une pipette de 10 ml. Centrifuger la suspension à 1200 xg pendant 20 min à température ambiante sans frein.</li&gt;<li&gt; Recueillir soigneusement l&#39;eau dessus et les couches d&#39;interphase et le transfert à un nouveau tube de 50 ml à centrifuger conique par pipetage de l&#39;interface air-eau sans tourbillonnant de la pipette. Il est important de minimiser les reports de saccharose tout en recueillant la couche d&#39;interphase.</li&gt;<li&gt; Mélanger le reste du saccharose / fécale solution de granulés par vortex le tube.</li&gt;<li&gt; Répéter les étapes 3.4 et 3.5.</li&gt;<li&gt; Porter le volume des deux solutions interphase oocystes à 50 ml avec ddH<sub&gt; 2</sub&gt; O et centrifuger les tubes à 2000 xg pendant 10 minutes à température ambiante.</li&gt;<li&gt; Aspirer le surnageant de chaque tube et granulés resuspendre avec 5 ml de tampon TE et la piscine de la suspension des oocystes ensemble. Le volume total mis en commun devrait être de 10 ml.</li&gt;</ol&gt;<p class="jove_title"&gt; 4. CsCl gradient</p&gt;<ol&gt;<li&gt; Préparer un gradient discontinu de CsCl dans un tube de 50 ml en polycarbonate Oak Ridge en prenant soin de chaque couche sous-jacente en utilisant une seringue de 50 ml avec un calibre 18 à extrémité franche, autoclavable, aiguille en acier, et un robinet d&#39;arrêt 2 voies. Remarque: le rouge de phénol est ajouté à la solution B de distinguer facilement entre les couches de gradient (tableau 1).</li&gt;<li&gt; Ajouter lentement les solutions suivantes pour le tube dans l&#39;ordre indiqué ci-dessous. Il faut noter que le débit ne doit pas dépasser de plus de 0,5 ml / sec.<ol&gt;<li&gt; 10 ml de l&#39;échantillon de suspension TE / oocystes</li&gt;<li&gt; Solution 8 ml Une</li&gt;<li&gt; 8 ml de solution B</li&gt;<li&gt; 8 ml de solution C</li&gt;</ol&gt;</li&gt;<li&gt; Centrifuger le tube Oak Ridge à 12.000 xg pendant 60 min à 4 ° C sans frein. L&#39;utilisation d&#39;un rotor à angle fixe est acceptable, mais une grande vitesse balancer les résultats seau dans une meilleure séparation des oocystes dans l&#39;échantillon de suspension avec un minimum de débris frottis fécal sur le côté ou le tube. L&#39;étendue des frottis dépend de la composition de la suspension fécale et donc il peut être nécessaire d&#39;effectuer deux gradients de CsCl si la suspension fécale est extrêmement sale.</li&gt;<li&gt; Après la centrifugation, recueillir la bande oocyste opaque / blanc contenant entre les solutions A et B. Pour minimiser la contamination par des débris fécaux, allez directement à la bande oocyste sans déranger le gradient et de recueillir l&#39;interphase oocyste aide d&#39;une pipette de 10 ml. Transfert de l&#39;oocyste interphase à un nouveau tube de 50 ml à centrifuger conique. Essayez de minimiser la quantité de solution de CsCl aspiration tout en recueillant l&#39;oocyste interphase car il peut poser un problème dans la granulation du oocystes pendant l&#39;étape de lavage.</li&gt;<li&gt; Lavez les oocystes avec 30-40 ml de DDH<sub&gt; 2</sub&gt; O. Centrifuger le tube à 2000 xg à température ambiante pendant 10 min sans frein. Aspirer délicatement le surnageant sans perturber le culot d&#39;oocystes. Répéter les 2 lavez fois supplémentaires.</li&gt;<li&gt; A la fin du dernier lavage, aspirer délicatement le surnageant et resuspendre le culot dans 10 ml d&#39;acide sulfurique à 2% et conserver à 4 ° C jusqu&#39;à utilisation. Les oocystes sont maintenant prêts pour d&#39;autres manipulations. La pureté des oocystes peut être contrôlé au microscope par l&#39;absence de débris fécaux dans l&#39;échantillon.</li&gt;</ol

<ol><li>Dubey, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevalence+of+viable+Toxoplasma+gondii+in+beef%2C+chicken%2C+and+pork+from+retail+meat+stores+in+the+United+States%3A+risk+assessment+to+consumers%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Prevalence of viable Toxoplasma gondii in beef, chicken, and pork from retail meat stores in the United States: risk assessment to consumers.</a> J. Parasitol. 91, 1082-1093 (2005).</li>
<li>Tenter, A. M., Heckeroth, A. R., Weiss, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxoplasma+gondii%3A+from+animals+to+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Toxoplasma gondii: from animals to humans.</a> Int. J. Parasitol. 30, 1217-1258 (2000).</li>
<li>Bowie, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Outbreak+of+toxoplasmosis+associated+with+municipal+drinking+water%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Outbreak of toxoplasmosis associated with municipal drinking water.</a> Lancet. 350, 173-177 (1997).</li>
<li>Moura, L. de <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Waterborne+toxoplasmosis%2C+Brazil%2C+from+field+to+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Emerg.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Waterborne toxoplasmosis, Brazil, from field to gene.</a> Emerg. Infect. Dis. 12, 326-329 (2006).</li>
<li>Jones, J. L., Dubey, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Waterborne+toxoplasmosis+-+Recent+developments%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Waterborne toxoplasmosis - Recent developments.</a> Exp. Parasitol. doi: 10.1016/j.exppara.2009.03.013, (2009).</li>
<li>Dumetre, A., Darde, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+to+detect+Toxoplasma+gondii+oocysts+in+environmental+samples%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">How to detect Toxoplasma gondii oocysts in environmental samples.</a> FEMS Microbiol. Rev. 27, 651-661 (2003).</li>
<li>Dumetre, A., Darde, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+Toxoplasma+gondii+oocysts+by+cesium+chloride+gradient%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microbiol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Purification of Toxoplasma gondii oocysts by cesium chloride gradient.</a> J. Microbiol. Methods. 56, 427-4230 (2004).</li>
<li>Dubey, J. P. Toxoplasmosis of Animals and Man. , 2nd Edition, CRC Press, Inc. Boca Raton, FL. (2009).</li>
</ol>

obtention hautement purifiée toxoplasma gondii les oocystes par un gradient de chlorure de césium discontinu

Obtaining Highly Purified Toxoplasma gondii Oocysts by a Discontinuous Cesium Chloride Gradient

Toxoplasma gondii est un protozoaire pathogène intracellulaire obligatoire qui infecte habituellement les humains. C&#39;est un apicomplexes bien caractérisés liés à l&#39;origine des flambées des maladies alimentaires et hydriques. L&#39;hôte définitif est l&#39;espèce féline, où la réplication sexuelle se produit résultant dans le développement de l&#39;oocyste hautement infectieuse et résistance à l&#39;environnement. L&#39;infection se produit par ingestion de kystes tissulaires à partir de viande contaminée ou d&#39;oocystes à partir du sol ou l&#39;eau. L&#39;infection est généralement asymptomatique chez les individus sains, mais les résultats dans une infection latente à vie qui peut se réactiver provoquant la toxoplasmose cérébrale et la mort si l&#39;individu devient immunodéprimés. Viande contaminée avec T. kystes gondii ont été la principale source d&#39;infection en Europe et aux Etats-Unis, mais les récents changements dans la gestion des animaux et des pratiques d&#39;élevage et la manipulation des aliments améliorés et les procédures de traitement ont sensiblement réduit la prévalence de T. kystes gondii dans la viande 1, 2. Néanmoins, la séroprévalence chez les humains demeure relativement élevé ce qui suggère que l&#39;exposition des sols contaminés oocystes ou de l&#39;eau est probable. En effet, épidémies d&#39;origine hydrique de la toxoplasmose ont été signalés dans le monde soutenant la théorie de l&#39;exposition à la forme des oocystes de l&#39;environnement pose un risque significatif pour la santé 3-5. À ce jour, les recherches sur la compréhension de la prévalence de T. oocystes gondii dans l&#39;eau et l&#39;environnement sont limitées en raison du manque d&#39;outils pour détecter les oocystes dans l&#39;environnement 5, 6. Cela est principalement dû à l&#39;absence de protocoles de purification efficaces pour obtenir un grand nombre de très purifiée T gondii oocystes des chats infectés à des fins de recherche. Cette étude décrit le développement d&#39;une méthode de CsCl modifiés qui purifie facilement T. oocystes gondii à partir des fèces des chats infectés qui sont appropriés pour la manipulation biologique moléculaire et la culture de tissus 7.

Cette étude décrit le développement d&#39;une méthode modifiée de CsCl qui purifie facilement T. gondii oocystes à partir des fèces des chats infectés qui sont appropriés pour la manipulation biologique moléculaire et la culture de tissus

Obtention hautement purifiée Toxoplasma gondii Les oocystes par un gradient de chlorure de césium discontinu

Toxoplasma gondii est un protozoaire pathogène intracellulaire obligatoire qui infecte couramment les humains. C'est un apicomplexiste bien caractérisé associé à ...

Toxoplasma gondii est généralement obtenu à partir des fèces de chats infectés et isolé par une procédure de flottaison, produisant une suspension partiellement purifiée, destinée aux analyses moléculaires et à la culture tissulaire. Cependant, les expériences sur ce parasite nécessitent des oocystes hautement purifiés. Les oocystes sont davantage purifiés par une étape de flottaison au saccharose, au cours de laquelle les oocystes sont remis en suspension, recouverts d'une solution de saccharose puis d'eau, et centrifugés afin de séparer les oocystes de la majeure partie des matières fécales.La couche d'OSIS est ensuite transférée dans un nouveau tube superposé de césium, de chlorure et centrifugé. La bande d'OSIS distincte résultante est alors collectée et lavée, prête à être utilisée dans des expériences nécessitant une teon io hautement purifiée. Bonjour, je suis le Dr. Sarah Staggs, employée de Dynam, une entreprise contractante du National Exposure Research Laboratory de l'Agence américaine de protection de l'environnement.Aujourd'hui, nous allons vous présenter une procédure permettant de purifier Toxoplasma Gandhi io Oasis à partir des fèces de chats de laboratoire infectés, en utilisant un gradient discontinu de chlorure de césium. Cette procédure est couramment utilisée dans notre laboratoire pour isoler l'OSI, destiné à être utilisé dans des expériences de biologie moléculaire et de culture tissulaire. Commençons donc.Avant d'entreprendre toute manipulation avec TG O Osis, des considérations importantes en matière de sécurité doivent être prises en compte. Les personnes immunodéprimées, enceintes ou cherchant activement à tomber enceintes ne doivent pas manipuler l'agent pathogène en raison du risque d'acquérir la toxoplasmose, qui peut provoquer des maladies et de graves malformations congénitales. X. Pour réduire le risque d'infection, réservez un espace dédié à cette procédure et affichez des panneaux d'avertissement destinés à informer les autres personnes avant qu'elles n'entrent dans la pièce.Pensez à porter une blouse de laboratoire, une blouse jetable, des gants jetables et une protection oculaire adéquate ou un écran facial lors de la manipulation de kystes T-One IO. Veillez à changer fréquemment vos gants et à éviter de toucher tout équipement avec des gants contaminés. Il est également important de travailler sur des plateaux en métal stérilisables par autoclavage, recouverts de revêtements absorbants jetables.Et dans cette optique, prenez une minute pour vous assurer que tous les porte-tubes, tubes et autres équipements que vous prévoyez d'utiliser sont soit jetables, soit autoclavables. Si vous utilisez des articles non jetables, veillez à les stériliser en les soumettant à deux cycles d'une heure au autoclave. Vous devrez également relier toutes les lignes de vide à un filtre de protection sous vide afin d'éviter de contaminer la pompe à vide.Lorsque vous avez terminé l'isolement des kystes, vous devez appliquer une solution fraîche d'hypochlorite à 10 % sur votre surface de travail. Laissez-la sécher, puis rincez la zone plusieurs fois à l'eau. Une fois les précautions de sécurité appropriées mises en place, vous pouvez poursuivre vos expériences.Avant la collecte de T Guni OYS, il faut d'abord préparer toutes les solutions nécessaires pour les gradients de saccharose, de flottaison et de chlorure de césium, ainsi que les étapes de centrifugation. Les solutions dont vous aurez besoin comprennent une solution de saccharose à 2,2 molaire stérilisée par un cycle de 20 minutes à l'autoclave, un litre de tampon TE à pH 7,2, une solution normale d'hydroxyde de sodium, une solution à 2 % d'acide sulfurique et une solution mère de chlorure de césium ayant une densité spécifique de 1,15.La solution mère de chlorure de césium à 1,15 sera utilisée pour préparer les solutions A, B et C, qui serviront à élaborer le gradient de chlorure de césium. La solution A est préparée en mélangeant 30 millilitres de TE avec 20 millilitres de la solution mère de chlorure de césium à 1,15 ; la solution B est préparée en mélangeant 20 millilitres de TE avec 30 millilitres de la solution mère de chlorure de césium à 1,15, puis en ajoutant 12,5 microlitres de solution de phénol rouge. Enfin, la solution C est préparée en mélangeant 10 millilitres de TE avec 40 millilitres de la solution de chlorure de césium à 1,15.Nous commencerons la préparation du gradient de saccharose en prélevant une suspension fécale de 10 millilitres de T osis dans de l'acide sulfurique à 2 % et en la transférant dans un tube conique de centrifugation de 50 millilitres. La matière fécale provient des selles de chats infectés qui ont déjà été traitées par une procédure de flottation au saccharose décrite précédemment dans un manuel rédigé par le Dr JP Duby, intitulé Toxoplasmosis of Animals and Humans. Cette étape supplémentaire réduit davantage la quantité de débris fécaux lors du processus de purification au chlorure de césium et permet d'obtenir la pureté la plus élevée des kystes de T goi.Nous neutralisons ensuite l'acide sulfurique en ajoutant trois cinquièmes du volume d'une solution normale d'hydroxyde de sodium à la suspension fécale. Mélangez bien la suspension par vortex. Ajoutez ensuite un volume égal de saccharose et mélangez bien la suspension par vortex.À l’aide d’un volume de 10 millilitres par boîte, recouvrez soigneusement la suspension fécale au saccharose avec 10 millilitres d’eau doublement distillée. Une fois cette étape terminée avec précaution, placez les tubes dans la centrifugeuse et centrifugez-les à 1200 ×g pendant 20 minutes à température ambiante, sans frein après la centrifugation. En prenant soin de ne pas perturber l’interface air-eau, prélèvez délicatement la couche supérieure aqueuse et l’interface à l’aide d’une pipette. Il est très important de tenter de minimiser la quantité de la couche de saccharose qui est transférée lors de la collecte de la couche d'interface. Transférez ces couches dans un nouveau tube conique de centrifugation de 50 millilitres. Vortexez le tube pour mélanger la solution restante du culot fécal au saccharose.Répétez une fois de plus la superposition d'eau précédente lors des étapes de centrifugation. Après la centrifugation, récupérez les couches supérieure aqueuse et interfaciale et transférez-les dans un nouveau tube. Utilisez de l'eau doublement distillée pour ajuster le volume des solutions interfaciales de deux oh oh kystes à 50 millilitres.Ensuite, centrifuger les tubes à 2000 × g pendant 10 minutes à température ambiante. Enfin, aspirer le surnageant S de chaque tube. Résuspender les culots dans cinq millilitres de tampon TEA et préparer les suspensions d'osmotique.Les osis sont désormais prêts pour l'étape du gradient de chlorure de césium. Nous commencerons par préparer un gradient discontinu de chlorure de césium dans un tube Oak ridge en polycarbonate de 50 millilitres. Ajoutez 10 millilitres de la suspension contenant du TE et les osis à l’aide d’une seringue de 50 millilitres équipée d’une aiguille en acier autoclavable, émoussée, de calibre 18, dans le tube en polycarbonate.Et, à l’aide d’un robinet bivalve, ajouter lentement les solutions suivantes directement au fond du tube. Huit millilitres de la solution A, huit millilitres de la solution B et huit millilitres de la solution C. Veiller à ce que le débit ne dépasse pas 0,5 millilitre par seconde. Il est également important de noter que le rouge de phénol présent dans la solution B permet de distinguer les couches du gradient.Vous êtes maintenant prêts à centrifuger le tube Oak ridge à 12 000 ×g pendant 60 minutes à quatre degrés Celsius sans frein, en utilisant un rotor à angle fixe et haute vitesse. Maintenant que la centrifugation est terminée, nous recueillons la bande blanche opaque située entre les solutions A et B. Cette bande contient les oocystes. À l’aide d’une pipette de 10 millilitres, allez directement jusqu’à la bande d’oocystes sans perturber le gradient et recueillez les oocystes.Essayez de minimiser la quantité de solution de chlorure de césium que vous aspirez lors de la collecte du kyste, car un excès de chlorure de césium pourrait rendre difficile la formation du culot de kystes lors du lavage. À l'étape suivante, transférez les OSIS dans un nouveau tube conique de centrifugeuse de 50 millilitres. Lavez ensuite les kystes O avec 30 à 40 millilitres d'eau doublement distillée, puis centrifugez le tube à 2000 × g pendant 10 minutes à température ambiante sans frein ; aspirez soigneusement le surnageant en prenant garde de ne pas perturber le culot de kystes O.Répétez le lavage deux fois supplémentaires. Une fois les derniers lavages terminés, aspirez soigneusement le surnageant et resuspendez le culot dans 10 millilitres d'acide sulfurique à 2 %. Vérifiez l'OSIS au microscope afin de vous assurer que tous les débris fécaux ont été correctement éliminés de l'échantillon.Les osis sont désormais prêts à subir des manipulations supplémentaires, ou vous pouvez les conserver à quatre degrés Celsius jusqu'à ce que vous soyez prêt à les utiliser. Voici une vue d'ensemble de l'aspect des osis non purifiés, observés au microscope à contraste d'interférence différentielle avec un grossissement de 400 x. Remarquez la présence de grandes quantités de contaminants fécaux dans le champ, ce qui rend très difficile l'identification des aides OSI.Voici à quoi ressemblent les OISS à 400 x après le protocole de purification par gradient de chlorure de césium. Remarquez l'absence de débris fécaux. Nous venons de vous montrer comment purifier Toxoplasma Gandhi Iasis à partir des fèces de chats infectés en laboratoire en utilisant un gradient discontinu de chlorure de césium.Lors de cette procédure, il est important de se rappeler de respecter toutes les consignes de sécurité et de toujours faire preuve de prudence lors de la superposition du gradient de chlorure de césium, en ajoutant chaque couche très lentement et en s'efforçant de ne pas perturber ni mélanger le gradient. Voilà, c'est tout. Merci d'avoir regardé et bonne chance dans vos expériences.

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Fonction de mesure d'anticorps est la clé de la compréhension de l'immunité au paludisme à Plasmodium falciparum. Cette méthode décrit la purification de mérozoïtes viables, et la mesure de la phagocytose dépendante de l'opsonisation par cytométrie de flux.

High Yield purification de<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt; Mérozoïtes Pour utilisation en opsonisants Anticorps dosages

Cette méthode de séparation des trypanosomes dans le sang dépend de leur charge de surface étant moins négatif que les cellules de sang de mammifères. Sang contaminé est placé et traité sur une colonne d’échangeur d’anions. Cette méthode, plus raccord diagnostique pour la trypanosomiase africaine, fournit parasites purifiées à des investigations immunologiques, biologiques, biochimiques, pharmaceutiques et de la biologie moléculaire.

Purification des Trypanosomes extracellulaires, y compris les pays d’Afrique, du sang par échangeurs d’anions (colonnes diéthylaminoéthyl-cellulose)

Cet article détaille un protocole pour la préparation d'une co-culture de cellules cryptococciques et d'amibes qui est étudiée à l'aide d'images fixes fluorescentes et d'images de microscope électronique à transmission haute résolution. Illustré ici est comment les données quantitatives peuvent compléter ces informations qualitatives.

Utilisation complémentaire des techniques microscopiques et de la lecture de fluorescence dans l'étude des interactions Cryptococcus-Amoeba

Nous décrivons des protocoles pour préparer des oocysts et purifier des sporozoites pour étudier l'infection des organoïdes intestinaux et de voie aérienne humains par Cryptosporidium parvum. Nous démontrons les procédures pour la microinjection des parasites dans le lumen intestinal organoïde et l'immunostaining des organoïdes. Enfin, nous décrivons l'isolement des oborcystes générés des organoïdes.

Étudier l'infection à Cryptosporidium dans les systèmes de culture organoïde humaine dérivés de tissus 3D par microinjection

Ici, nous décrivons les conditions de culture in vitro , l’isolement et la génération accrue de vésicules extracellulaires (VE) à partir d’Echinococcus granulosus. Les petits VE ont été caractérisés par une diffusion dynamique de la lumière et une microscopie électronique à transmission. L’absorption par les cellules dendritiques dérivées de la moelle osseuse et leur modulation phénotypique ont été étudiées à l’aide de la microscopie confocale et de la cytométrie en flux.

Isolement et absorption par des cellules dendritiques de petites vésicules extracellulaires d’Echinococcus granulosus

Apprenez à purifier les oocystes de Toxoplasma gondii à haute pureté à l'aide d'un gradient discontinu de chlorure de césium. Cette méthode permet d'obtenir des parasites adaptés aux expériences de biologie moléculaire et de culture tissulaire.

Obtention hautement purifiée Toxoplasma gondii Les oocystes par un gradient de chlorure de césium discontinu

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