Name: Mésoscopique fluorescence tomographie pour In vivo Limagerie du développement Drosophile /em (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-08-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 51 s
Description: Découvrez la tomographie de fluorescence mésoscopique pour l'imagerie in vivo du développement organique chez Drosophila melanogaster. Cette technique avancée permet la reconstruction 3D en temps réel des disques imaginaires alaires exprimant la GFP.

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C. Vinegoni reconnaît le soutien de National Institutes of Health (NIH) accorder une-SR1-EB006432.

Les stocks de Drosophila melanogaster utilisés dans cette expérience sont les suivantes: <ul style="list-style-type:none;"><li> elav-Gal4 (FBti0002575) </li><li> AP-Gal4md544 (FBal0051787) </li><li> SAMU-srcEGFP (FBti0013990) </li><li> w1118 (FBal0018186) </li></ul> Pour toutes les expériences, le système UAS-Gal4 a été utilisé pour surexprimer la GFP dans les tissus d&#39;intérêt (c&#39;est à dire des glandes salivaires ou les disques d&#39;aile). Plus précisément, les mouches femelles transgéniques avec les Gal4 appropriés ont été croisés pour SAMU-EGFP compagnons transgéniques. Les croisements ont été élevés à 25 ° C dans un incubateur humidifié. Lorsque les nymphes commencent peupler les flacons (environ 5-6 jours après le début de la croix), ils ont été sélectionnés pour fluorescence de la GFP au stade blanche prépupal (0-1 h après la formation puparium) et collectées pour la tomographie par imagerie. <ol><li> Mettre en place des croisements appropriés et à l&#39;arrière à 25 ° C </li><li> 5-6 jours après l&#39;initiation de la croix, sélectionnez la descendance fluorescentes pour l&#39;imagerie. Utilisez un pinceau humide pour enlever en douceur de l&#39;prénymphes blanches sur les côtés de la fiole. </li><li> Mettez prénymphes dans une goutte d&#39;eau ou du PBS placé dans une boîte de Pétri pour enlever les particules de nourriture et de la colle qui couvre le cas de nymphe et rend le spécimen autofluorescente. Nettoyez délicatement avec un pinceau. Si le vieillissement de la pupe est nécessaire, endroit choisi prénymphes blanc dans une boîte de Pétri avec une serviette en papier humide (une chambre humide) ou sur les côtés d&#39;une cuvette propre avec de la nourriture volée. Cela permettra d&#39;assurer qu&#39;il ya suffisamment d&#39;humidité, afin de permettre le bon développement de l&#39;animal. </li></ol> Drosophile montage <ol><li> Collez la partie inférieure de la coque de nymphose dans un tube capillaire en verre (800 microns de diamètre) de telle sorte que antérieure / postérieure de la mouche axe est orienté parallèlement au tube. </li><li> Fixer le tube capillaire à la verticale sur une étape de rotation. </li><li> Ajuster l&#39;axe de basculement de la phase de rotation pour que l&#39;axe de rotation parallèle à des colonnes de pixels de l&#39;imagerie CCD. </li></ol> Détermination Forward modèle <ol><li> Fixer une chrysalide dans un capillaire en verre et montez comme décrit précédemment </li><li> Remplir un tube capillaire de silice (100 microns, DO) avec un colorant fluorescent (Cy5.5) </li><li> Insérez le tube capillaire à l&#39;intérieur de la pupe à 45 degrés par rapport à l&#39;axe antérieur / postérieur </li><li> Illuminer la nymphe avec un faisceau laser d&#39;excitation avec un objectif d&#39;ouverture numérique faible. Collecter des images de fluorescence transillumination plus de 360 ​​degrés de rotation de la pupe long de son axe vertical. </li><li> Ajuster les données expérimentales avec un modèle approprié avant </li></ol> Glandes salivaires Imaging <ol><li> Monter une nymphe exprimer la GFP dans les glandes salivaires, comme décrit précédemment </li><li> Éclairer avec un faisceau d&#39;excitation et de recueillir en transillumination du signal de fluorescence GFP plus de 360 ​​degrés de rotation de la pupe long de son axe vertical. </li><li> Reconstruire les données acquises en utilisant le modèle de l&#39;avant </li></ol> Imagerie time-lapse <ol><li> Monter une GFP blanche prénymphe exprimer dans les disques imaginaux de l&#39;aile </li><li> Gardez à l&#39;environnement d&#39;imagerie et humide à température ambiante pour éviter la déshydratation de la nymphe. </li><li> Placer un obturateur pour éviter un éclairage continu </li><li> Éclairer avec un faisceau d&#39;excitation et de recueillir en transillumination du signal de fluorescence GFP plus de 360 ​​degrés de rotation de la pupe long de son axe vertical. </li><li> Reconstruire les données acquises en utilisant le modèle de l&#39;avant. </li></ol> Histologie <ol><li> Disséquer les glandes salivaires du SNC / disques oeil dans du PBS 1X. </li><li> Fixer les tissus dans le formol à 4%, 1x PEM (Pipes 100 mM, 1 mM EGTA, 1 mM MgCl 2) pendant 20min à température ambiante. </li><li> Retirer de fixation et de montage dans Vectashield au DAPI (Vector) </li><li> Image avec un microscope à fluorescence. </li></ol> Time-Lapse Histologie <ol><li> Recueillir prénymphes blancs et les mettre en scène dans une chambre humide. </li><li> Recueillir les pupes à différents stades de développement </li><li> Piquer la coque de nymphose deux fois (0 h après la formation puparium) avec une aiguille fine (insecte broches 000, FST) avant la fixation. </li><li> Fix pupes dans formaldéhyde à 8%, 1x PEM pour 6-8 heures à température ambiante avec agitation douce. </li><li> Après le retrait de fixation et de rinçage avec du PBS 1x, couper la nymphe fixes avec une lame tranchante en deux morceaux perpendiculairement à l&#39;axe A / P; </li><li> Immerger les deux pièces en Vectashield au DAPI (Vector) et monter sur des lames couvre-objet (Lab-Tek) pour l&#39;imagerie. </li><li> Acquérir les images avec un microscope à fluorescence confocale. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1510/1510fig1thumb.jpg" alt="Figure 1" border="0" /> Figure 1. S&#39;il vous plaît <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1510/1510fig1.jpg">cliquez ici</a> pour voir alVersion Arger de la figure 1.

<ol><li>Ntziachristos, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Looking+and+listening+to+light%3A+the+evolution+of+whole-body+photonic+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Looking and listening to light: the evolution of whole-body photonic imaging.</a> Nat. Biotechnol. 23, 313-320 (2005).</li>
<li>J, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+projection+tomography+as+a+tool+for+3D+microscopy+and+gene+expression+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Optical projection tomography as a tool for 3D microscopy and gene expression studies.</a> Science. 296, 541-545 (2002).</li>
<li>Dodt, H. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultramicroscopy%3A+three-dimensional+visualization+of+neuronal+networks+in+the+whole+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Ultramicroscopy: three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain.</a> Nat. Methods. 4, 331-336 (2007).</li>
<li>Vinegoni, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+Drosophila+melanogaster+pupae+with+mesoscopic+fluorescence+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of Drosophila melanogaster pupae with mesoscopic fluorescence tomography.</a> Nat. Methods. 5, 45-47 (2008).</li>
</ol>

Les auteurs n'ont rien à divulguer.

In vivo reconstructions de l&#39;affaire de nymphe et les glandes salivaires exprimant la GFP d&#39;un D. melanogaster prénymphe (barre d&#39;échelle, 500 microns) avec l&#39;histologie correspondante (en bleu, la coloration DAPI; vert, fluorescence de la GFP) est montré dans la figure 1 (a). Time-lapse série d&#39;imagerie de D. melanogaster aile disques imaginaux est indiqué dans la Fig.1 (b). Les images sont acquises à partir d&#39;un seul spécimen vivant, à quatre points de temps différentes (0,3.0...

mésoscopique fluorescence tomographie pour in vivo l&#39;imagerie du développement drosophile</em

Mesoscopic Fluorescence Tomography for In-vivo Imaging of Developing Drosophila

Visualiser la formation des organes en développement ainsi que progession et le traitement de la maladie repose souvent lourdement sur la capacité à interroger optiquement les changements moléculaires et fonctionnelles dans les organismes vivants intacts. La plupart des méthodes existantes d&#39;imagerie optique sont insuffisants pour l&#39;imagerie à des dimensions qui se trouvent entre les limites de pénétration de la microscopie optique moderne (0,5-1mm) et les limites imposées par diffusion de la macroscopie optique (&gt; 1 cm) [1]. Ainsi, de nombreux organismes modèles importants, par exemple insectes, des embryons animaux ou des extrémités du petit animal, restent inaccessibles pour l&#39;imagerie in vivo optique. Bien qu&#39;il y ait un intérêt croissant envers le développement de nanomètre résolution méthodes d&#39;imagerie optique, il n&#39;ya pas eu beaucoup d&#39;efforts réussi à améliorer la profondeur de pénétration d&#39;imagerie. La capacité d&#39;effectuer l&#39;imagerie in vivo au delà des limites de microscopie est en fait rencontré des difficultés liées à la diffusion de photons présents dans les tissus. Les efforts récents pour embryons image entière par exemple [2,3] nécessitent un traitement chimique spécial de l&#39;échantillon, pour les faire disparaître de la diffusion, une procédure qui permet de les utiliser uniquement pour l&#39;imagerie post-mortem. Ces méthodes cependant des preuves de la nécessité pour les spécimens d&#39;imagerie plus grandes que celles habituellement autorisés par microscopie à deux photons ou confocale, en particulier dans la biologie du développement et de découverte de médicaments. Nous avons développé une nouvelle technique d&#39;imagerie optique de fluorescence nommée mésoscopique tomographie [4], qui convient pour les non-invasives d&#39;imagerie in vivo à des dimensions de 1mm à 5mm. La méthode de résolution des échanges pour la profondeur de pénétration, mais offre sans précédent de l&#39;imagerie tomographique performance et il a été développé pour ajouter du temps comme une dimension nouvelle dans les observations de biologie du développement (et éventuellement d&#39;autres domaines de la recherche biologique) en donnant la possibilité à l&#39;image de l&#39;évolution de la fluorescence taggés réponses au fil du temps. Comme telle, elle peut accélérer les études des dépendances morphologiques ou fonctionnelles sur les mutations des gènes ou des stimuli extérieurs, et peut surtout, capter l&#39;image complète du développement ou de la fonction des tissus en permettant longitudinale time-lapse de visualisation de la même, l&#39;organisme en développement. La technique utilise un microscope de laboratoire modifié et multi-projection d&#39;illumination pour recueillir des données à 360 degrés des projections. Elle s&#39;applique à la simplification de Fermi à la solution de Fokker-Plank de l&#39;équation de transport des photons, combinée avec les principes de l&#39;optique géométrique afin de construire un système d&#39;inversion réalistes adapté à une large échelle mésoscopique. Cela permet in vivo du corps entier de visualisation de la non-transparence des structures tridimensionnelles dans des échantillons de plusieurs millimètres dans la taille. Nous avons démontré la performance in vivo de la technique par imagerie en trois dimensions des structures de développement de tissus in vivo chez la drosophile et en suivant la morphogenèse des ailes dans l&#39;opaque pupes de drosophile en temps réel de plus de six heures consécutives.

Mésoscopique de fluorescence de tomographie opère au-delà des limites de la pénétration des tissus sectionnement microscopie à fluorescence. La technique est basée sur la multi-projection de l&#39;illumination et une description de transport des photons. Nous démontrons in vivo du corps entier de visualisation 3D de la morphogenèse des ailes exprimant la GFP dans les disques imaginaux<em&gt; Drosophila melanogaster.</em

Mésoscopique fluorescence tomographie pour In vivo L&#39;imagerie du développement Drosophile</em

La visualisation de la formation d'organes en développement, ainsi que de la progression et du traitement de maladies, repose souvent largement sur la capacité d'interroger optiquement...

Afin de réaliser les reconstructions d'organes en développement chez Drosophila melanogaster, nous devons déterminer le modèle direct qui décrit le mieux la propagation de la lumière à l'intérieur de la pupe elle-même. La procédure commence par la sélection d'une pré-pupe blanche, que l'on colle à l'extrémité d'un tube capillaire de manière à orienter l'axe antéro-postérieur de la pupe parallèlement au tube. Un petit tube capillaire rempli d'un colorant fluorescent est inséré dans l'enveloppe pupale.Après un réglage minutieux des axes, la nymphe est tournée de 360 degrés. Des images sont acquises selon différents angles. Les données d'illumination transversale fluorescente acquises sont utilisées pour déterminer le modèle direct qui sera employé pour imager le développement des organes.Bonjour, je m'appelle Claudia et je travaille au Centre d'assistance en biologie du Massachusetts General Hospital, de la Harvard Medical School. Je suis Ula Petou du laboratoire Paramount de la Harvard Medical School, et je suis Daniel Rozanski de l'Institut d'imagerie biologique et médicale de l'Université technique de Munich et du centre Heliman Munich. Aujourd'hui, nous allons vous montrer une pr

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Hémocytes drosophile se dispersent sur ​​l'ensemble de l'embryon en développement. Ce protocole démontre comment monter et à l'image de ces migrations à partir d'embryons avec les hémocytes marqués par fluorescence.

En direct de l&#39;imagerie Drosophila melanogaster Migrations hémocytaires embryonnaires

Source : Hellerman, M. B., et al. Imagerie en direct de l’œil de la drosophile nymphale. J. Vis. Exp. (2015)La vidéo montre une technique d’imagerie en direct pour étudier les motifs oculaires d’une chrysalide de Drosophila melanogaster. Les marqueurs marqués à la protéine fluorescente verte (GFP) permettent de visualiser l’organisation cellulaire et la différenciation pendant la formation de la structure oculaire en développement.

Imagerie en direct de l’œil de la chrysalide de la drosophile à l’aide de la microscopie à fluorescence

La méthode de tomate / GFP-FLP / FRT implique visualiser les cellules photoréceptrices de la mosaïque à vivre la drosophile. Il peut être utilisé pour suivre le destin des cellules individuelles des photorécepteurs dans la rétine pendant des jours ou des semaines. Ce procédé est idéal pour l'étude de la dégénérescence rétinienne et les maladies neurodégénératives ou le développement des cellules de photorécepteur.

Le / GFP-FLP Méthode tomate / FRT pour l&#39;imagerie en direct de mosaïque adulte<em&gt; Drosophila</em&gt; cellules photoréceptrices

Ce document illustre l'utilisation d'un balayage rapide microscope confocal à un comportement cellulaire de l'image directement à travers la pupe. En laissant la coque de nymphose intacte, cette méthode permet l'observation et la mesure des processus dynamiques de cellule à un stade de développement de la drosophile qui est difficile à étudier directement.

Imagerie à travers le cas de la nymphe<em&gt; Drosophila melanogaster</em

L’immunomarquage est une technique efficace pour visualiser des types de cellules et des protéines spécifiques dans les tissus. En utilisant la sonication, le protocole décrit ici réduit la nécessité de disséquer les tissus de Drosophila melanogaster des embryons et des larves à un stade avancé avant l’immunomarquage. Nous fournissons une méthodologie efficace pour l’immunomarquage des larves de montures entières fixées au formaldéhyde.

Sonication facilitée immunofluorescence de phase tardive embryonnaire et larvaire<em&gt; Drosophila</em&gt; tissus<em&gt; In Situ</em

Ce protocole présente une méthode efficace pour l’imagerie du neuroépithélium de l’œil nymphal vivant de la drosophile. Cette méthode compense le mouvement des tissus et la topologie inégale, améliore la visualisation des limites cellulaires grâce à l’utilisation de plusieurs protéines de jonction marquées GFP et utilise un banc d’imagerie facile à assembler.

Live-imagerie de la Drosophila Nymphe yeux

Ici, nous illustrons comment microscopie photoactivation localisation seule molécule peut être effectuée sur le terminal de nerf moteur d’un live de Drosophila melanogaster troisième stade larve.

In Vivo Simple-molécule suivi du terminal de nerf moteur présynaptique Drosophila

Un protocole est présenté qui permet la visualisation de Drosophila melanogaster intact à n’importe quel stade de développement à l’aide de la tomographie microcalculée.

Imagerie d’animaux entiers de Drosophila melanogaster à l’aide de la tomographie microcalculée

La microscopie à fluorescence à base de feuilles de lumière est l’outil le plus précieux en biologie du développement. Un problème majeur dans les études comparatives est la variance ambiante. Notre protocole décrit un cadre expérimental pour l’imagerie en direct simultanée de plusieurs spécimens et, par conséquent, aborde cette question de manière proactive.

Imagerie en direct simultanée d’embryons d’insectes multiples dans des microscopes à fluorescence à feuille de lumière à base de chambre d’échantillonnage

Au début de l’embryon de drosophile , de nombreux organites sont mobiles. En principe, ils peuvent être photographiés en direct via des sondes fluorescentes spécifiques, mais la coquille d’œuf empêche l’application directe sur l’embryon. Ce protocole décrit comment introduire de telles sondes par microinjection, puis analyser le mouvement des organites en vrac via la vélocimétrie d’image de particules.

Visualisation du trafic dépendant du cytosquelette d’organites contenant des lipides dans des embryons de drosophiles

Ici, un protocole pour la mise en œuvre de la microscopie d’expansion dans les embryons précoces de drosophile afin d’obtenir une imagerie à super-résolution à l’aide d’un microscope confocal conventionnel à balayage laser est présenté.

Utilisation de la microscopie d’expansion pour agrandir physiquement des embryons de drosophile entiers pour l’imagerie à super-résolution

Découvrez la tomographie de fluorescence mésoscopique pour l'imagerie in vivo du développement organique chez Drosophila melanogaster. Cette technique avancée permet la reconstruction 3D en temps réel des disques imaginaires alaires exprimant la GFP.

Mésoscopique fluorescence tomographie pour In vivo L'imagerie du développement Drosophile

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