Mésoscopique fluorescence tomographie pour In vivo L'imagerie du développement Drosophile

Afin d’effectuer les reconstructions des organes en développement au sein de la Drosophila melanogaster, nous devons déterminer le modèle direct qui décrit le mieux la propagation de la lumière à l’intérieur de la chrysalide elle-même. La procédure commence par la sélection d’une pré nymphe blanche et son collage à l’extrémité d’un tube capillaire de sorte que l’axe antérieur et postérieur de la poppa soit orienté parallèlement au tube. Un petit tube capillaire est rempli d’un colorant fluorescent et inséré dans le boîtier de la pupille.

Après un réglage minutieux de l’axe, la chrysalide est tournée à 360 degrés. Les images sont acquises sous différents angles. Les données d’éclairage fluorescent trans acquises sont utilisées pour déterminer le modèle avant qui sera utilisé pour imager le développement des organes.

Bonjour, je m’appelle Claudia et je travaille au Center for Assistance Biology du Massachusetts General Hospital, Harvard Medical School. Je m’appelle Ula Petou du laboratoire Paramount de la faculté de médecine de Harvard, et je m’appelle Daniel Rozanski de l’Institut d’imagerie biologique et médicale de l’Université technique de Munich et du Centre Heliman de Munich. Aujourd’hui, nous allons vous montrer une procédure de reconstruction tridimensionnelle de tout le corps à Oph Melano Casta.

Nous utilisons cette procédure dans notre laboratoire pour la visualisation in vivo du développement des organes pendant l’état de la pupille. Alors commençons, avant de commencer. Veuillez noter qu’il n’y a pas de vidéo d’accompagnement qui devrait être visionnée avant celle-ci, où certains aspects techniques de la tomographie par projection optique sont expliqués plus en détail qu’ils ne le sont ici.

En outre, l’autre vidéo explique l’imagerie de tissus ou d’organes préparés d’animaux plus grands. Pour toutes les expériences couvertes dans cette vidéo, des transgènes de drosophile forgée seront utilisés. Il s’agit de EL A gal quatre exprimé dans les glandes salivaires, d’apteris gal quatre, qui est exprimé dans les tissus précurseurs larvaires de l’aile et du thorax adultes, le transgène qui fabrique la protéine fluorescente.

En réponse à la gal quatre appelée U-A-S-G-F-P et au blanc 1118, les mâles témoins non fluorescents porteurs des transgènes UAS sont croisés avec des femelles vierges portant les quatre transgènes GAL pour obtenir des tissus. L’expression spécifique des croisements GFP est mise en place de huit à 10 femelles et mâles vierges sur un milieu moucheux standard avec une pincée de levure de boulanger. En surface, les flacons sont logés à 25 degrés Celsius dans un incubateur humidifié sous un cycle d’obscurité légère de 12 heures.

Deux jours après le début du croisement, les parents sont transférés dans un flacon frais et cinq à six jours plus tard, PUI commencera à peupler le flacon blanc PrepU. Je suis sélectionné pour l’expression de la GFP sous une lunette de dissection fluorescente. La sélection de pré pui blancs assure une bonne mise en scène des animaux puisqu’ils restent blancs pendant environ une heure.

Après la pupille, ils deviennent pigmentés ou brunâtres. Les pui exprimant la GFP sont délicatement collectés des flacons à l’aide d’un pinceau humide et placés dans une goutte d’eau ou de PBS dans une boîte de Pétri, acheter doit être essuyé des matériaux autofluorescents. À l’aide du pinceau, ils devraient maintenant être prêts pour l’imagerie tomographique.

Si le PrepU I doit continuer à vieillir pour arriver au bon stade de développement, il peut être laissé dans une boîte de Pétri avec une serviette en papier humide ou dans un flacon alimentaire propre. Cela garantira une humidité suffisante et un bon développement pour l’imagerie. Le PrepU doit être collé à l’intérieur d’un tube capillaire en verre de 800 microns de diamètre.

Peignez l’extrémité postérieure de la pupille avec de la super colle, orientez la surface collée de la pré nymphe dans le tube de sorte que l’accès antérieur et postérieur de la mouche soit parallèle au tube. La partie antérieure de l’animal surplombera le tube capillaire. Le tube capillaire est maintenant fixé sur la platine de rotation du microscope.

En position verticale, ajustez l’axe d’inclinaison de l’étage de rotation de sorte que l’axe de rotation du tube soit parallèle aux colonnes de pixels du CCD d’imagerie. Une fois la position de la mouche ajustée, procédez à l’imagerie. Dans cet exemple, les animaux avec des glandes salivaires fluorescentes doivent être imagés à oph l’expression de la GFP dans leurs glandes salivaires peut être générée à partir d’un croisement entre les stocks EAG quatre et U-A-S-G-F-P.

Nous commençons avec une pré pupe montée, nous allumons la pré nymphe avec un faisceau d’excitation et collectons le signal fluorescent GFP. Dans le transéclairage, faites pivoter le PrepU à 360 degrés le long de son axe vertical et acquérez les images de transéclairage. Chaque image correspond à 10 degrés de rotation.

Le temps d’acquisition total dépend de la quantité de fluorescence et de l’intensité du faisceau d’excitation. Les temps typiques sont de l’ordre d’une minute. Dans cet exemple, une chrysalide DSO exprimant la GFP dans les disques imaginaux de l’aile sera imagée.

Cette chrysalide peut être recueillie à partir d’une fiole d’un croisement entre des souches d’Aus GAL quatre et d’U-A-S-G-F-P. La pré nymphe est montée comme décrit précédemment. Cependant, étant donné que le temps d’imagerie pour cette expérience est d’environ huit heures, il est essentiel que l’environnement reste humide et à température ambiante Pour éviter la déshydratation et la mort de l’animal, un obturateur est placé sur le faisceau d’excitation pour empêcher l’extinction des quatre floraux dans le tissu d’intérêt, ainsi que pour s’assurer que l’animal n’est pas brûlé par le faisceau laser comme auparavant, éclairer avec le faisceau d’excitation et collecter le signal fluorescent GFP par trans-éclairage.

La pré nymphe est complètement tournée le long de son axe vertical. Lors de la collecte des données, la rotation ne dure qu’une minute et est répétée à différents intervalles de temps. Pour créer une série d’images en accéléré des ailes pendant le développement, les données peuvent être acquises pendant au moins six heures à une vitesse de 100 images par heure.

Il est essentiel que l’exposition totale à la lumière soit contrôlée avec cet obturateur afin d’éviter les dommages ou le blanchiment photo. Ce film montre des images acquises entre l’étape PrepU et l’aversion de la tête d’élève. Lors de la reconstruction de l’image tridimensionnelle, il y a une forte diffusion vers l’avant qui doit être prise en compte, qui ne peut pas être approximée par la diffusion.

Donc, pour faire la reconstruction, un modèle de diffusion vers l’avant de la propagation de la lumière doit être déterminé. Pour simplifier, nous négligeons l’absorption. La quantité de diffusion est testée expérimentalement. Pour ce faire, un objet étranger à fluorescence standardisée est inséré dans la pré-nymphe 1118 blanche non fluorescente, qui est ensuite balayée pour générer les données du modèle avant, en commençant par remplir un tube capillaire en silice de 100 microns avec un colorant fluorescent PS 5.5.

À l’aide de l’action capillaire, poussez le tube capillaire dans la chrysalide à un angle de 45 degrés par rapport à l’axe antérieur, montez le PrepU dans un tube capillaire et positionnez-le de manière appropriée sur la platine rotative comme décrit précédemment. Illuminez maintenant la pré nymphe avec un faisceau laser d’excitation avec une lentille à faible ouverture numérique et collectez des images fluorescentes trans illumination de la pré nymphe. Comme décrit précédemment, le logiciel MATLAB est utilisé pour ajuster les données dans le modèle théorique explicite vers l’avant. Pour faciliter le processus de reconstruction, l’approximation ferme e de l’équation de transport est sélectionnée car elle décrit le régime de diffusion vers l’avant et s’ajuste également aux données expérimentales.

Après avoir déterminé le bon modèle avant, nous pouvons reconstruire les glandes salivaires et obtenir les reconstructions tomographiques en accéléré. Si vous prévoyez d’utiliser une tomographie en espace libre, des algorithmes de configuration pour la correspondance d’index peuvent également être mis en place. Tout d’abord, nous montrons une reconstruction 3D des glandes salivaires au début du développement.

À titre de comparaison, la coloration histologique des glandes salivaires montre que les reconstructions sont bien corrélées avec l’histologie. Ce film en accéléré du développement des disques imaginaux de l’aile a été acquis à partir d’un seul spécimen vivant. À titre de comparaison, la coloration histologique du disque alaire aux mêmes points de temps montre que les reconstructions sont bien corrélées avec l’histologie.

Nous venons de vous montrer comment construire un système pour imager des structures tridimensionnelles au sein d’oph in vivo, et au fil du temps. Cela permet de nous suivre, la morphogenèse chez la drosophile, et de suivre le développement des ailes pendant six heures consécutives. Lors de cette procédure, il est crucial de choisir le bon modèle avant pour la propagation de la lumière chez la drosophile.

Cette méthode peut être utilisée en combinaison avec des techniques histologiques pour faire la lumière sur le développement des organes au cours des stades pupillaires, et elle peut être modifiée pour l’étude de différents organismes de taille similaire. Donc c’est tout. Merci d’avoir regardé et bonne chance dans vos expériences.