Name: Lisolement et la dérivation de cellules germinales embryonnaires de souris (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-10-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 1 s
Description: Découvrez l'isolement des cellules germinales embryonnaires de souris à 10,5-11,5 jours post coïtum. Cette méthode permet d'étudier la différenciation cellulaire et ses implications pour la recherche sur l'infertilité et le cancer.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Les auteurs tiennent à souligner l&#39;aide inestimable de: Dr Neal First et Kourtney Wilkinson pour le manuscrit d&#39;édition, le Dr Lucy Senter, le Dr Brigitte Willeford et Mike Basett de l&#39;aide pour les soins de formation et d&#39;animaux à l&#39;installation MSU ALAC souris accrédités; Dr Dwayne Wise pour son aide à la microscopie et la capture d&#39;image; Cesar Monroy, Hannah Swoope, et Bobbie Huddleston pour leur aide à la production vidéo à la MSU. Cette recherche a été financée par l&#39;Office de la recherche institutionnelle et le Département des sciences biologiques à la Mississippi State University.

Partie 1: Laparotomie souris enceintes <ol><li> Par dislocation cervicale, euthanasier une souris C57BL6J enceinte femelle à 10/05 au 11/05 DPC. </li><li> Nettoyer l'abdomen avec un savon antimicrobien, et puis, il raser. </li><li> Après le rasage, lavage de l'abdomen avec une solution saline. </li><li> Ensuite, séchez l'abdomen avec une gaze stérile. </li><li> Couvrir la souris avec un nouveau champ stérile. </li><li> Faire une incision ventrale aide de pinces et de ciseaux de dissection. </li><li> Identifier et éliminer tout l'utérus de la cavité abdominale. Embryons de souris sera visible à l'intérieur de l'utérus. </li><li> Transfert de l'utérus dans une boîte de Pétri remplie de D-PBS, et le garder sur la glace. </li><li> L'utilisation d'un scalpel stérile et pince, retirer le placenta et les tissus embryonnaires supplémentaires de chaque embryon. </li><li> Transfert des embryons dans un plat frais de Pétri remplie de D-PBS. </li><li> Mesurer la longueur de l'embryon de souris. Nous avons constaté que les tailles diffèrent en fonction de l'âge de l'embryon. Par exemple 8,5 dpc mesurée à une moyenne de 6 mm, 10,5 jpc mesurée à une moyenne de 11mm, et 12,5 jpc mesurée à une moyenne de 16 mm. </li><li> Ensuite, retirer leurs queues pour l'extraction de l'ADN. </li></ol> Partie 2: Dissection Ridge gonadique Sous stéréomicroscope et Lumière de source Schott Fostec <ol><li> Placez un papier filtre dans une boîte de Pétri. Ensuite, placer l'embryon de souris au-dessus du papier filtre pour sécher l'embryon et immobiliser pour la dissection. </li><li> L'utilisation d'un scalpel stérile, faire une coupe transversale de l'embryon de souris au-dessus de l'origine du cordon ombilical. </li><li> Sous un microscope stéréoscopique, en utilisant une pince fine stérile et une aiguille stériles moqueries fines, enlever les intestins et le foie de sorte que le système urinaire est visible. Les reins sont situés latéralement dans la cavité abdominale et la vessie se situe médiale et caudale par rapport aux reins. L'embryon peut être identifiée comme masculine, car les crêtes gonadiques sont situés de chaque côté de la vessie. Chez la femelle, les crêtes gonadiques sont fermement attachés à l'extrémité caudale latérale du rein. </li><li> Peler les crêtes génitales à en glissant une aiguille derrière elle. La crête gonadique est enlevé en coupant les tissus qui la soutiennent. </li><li> Transférer les crêtes gonadiques d'un nouveau plat de Pétri remplie de fraîcheur D-PBS. Au microscope, la crête gonadique masculine devrait être dépouillé, grandes et de forme ovale. En revanche, la crête gonadiques chez la femme doivent être repérés, ont forme allongée et plus petite en comparaison de la crête gonadique masculine. </li></ol> Partie 3: Digestion Ridge gonadique Sous stéréomicroscope: <ol><li> Dissection mésonéphros: Séparez les gonades à partir du mésonéphros et dorsale à l'aide d'une aiguille fine et pointue. <ul><li> Il est important de retirer le mésonéphros de la crête gonadique car c'est un tissu somatique qui va proliférer dans le processus de dérivation PGC. </li></ul></li><li> Digestion Ridge gonadiques: Recueillir potable crêtes gonadiques par une baisse des frais 0.5ul D-PBS. Ajouter 20 ml de collagénase / dispase solution (concentration finale à 1mg/ml). <ul><li> Les embryons doivent être traités individuellement. Chaque embryon doit avoir son propre plat à part et étiquetés de Pétri. </li></ul></li><li> Gonadique Ridge Mincing: Couper la crête gonadique en petits morceaux à l'aide d'une aiguille stérile et stérile pinces fines n ° 4. </li><li> Incubation: boîtes de Pétri sont transférés à l'étuve à 37 ° C pendant 15 minutes. <ul><li> Le temps d'incubation peut varier entre les tissus. </li></ul></li><li> Pipetage: Après 15 minutes, le tissu peut être dissocié par pipetage. En utilisant des pipettes en verre tiré capillaire avec un diamètre compris entre 40 mm -100 Break up les morceaux par aspiration et refoulement. Ce sera sous forme de petites touffes. Transférer les touffes d'0.5ml d'une pré réchauffé D-PBS baisse pour un lavage final. </li><li> Après lavage, transférer les touffes de tubes Eppendorf. <ul><li> Ne pas surexposer le tissu à la collagénase. </li><li> Ne pas faire une suspension cellulaire unique. Ceci est important pour la formation de colonies. Si c'est une suspension cellulaire unique, PGC ont tendance à se différencier et migrer. </li><li> Ce processus ne devrait pas être plus long que 20 minutes, ou vos cellules vont perdre leur viabilité. </li></ul></li><li> Centrifuger à 2000 rpm pendant 5 minutes à température ambiante. </li><li> Après centrifugation, éliminer le surnageant et resuspendre le culot dans 0,5 ml de knock complétées par les médias (préchauffé à 37 ° C). </li></ol> Partie 4: Primordial Culture Germinal Cellules «Vous devriez effectuer les étapes suivantes rapidement pour préserver la viabilité des PGC pour l'isolement et la dérivation. <ol><li> 24 heures avant ce processus, vous devriez préparer un mitotiquement inactivé MEF-CF1 alimentation couche suivant le protocole de Zhang J. et al 2008. <ul><li> Préparer 20 plats pour un prégnant des femmes de la souris (6-8 embryons). </li><li> FAE perdre la capacité d'être une couche nourricière (promouvoir la croissance et empêcher la différenciation) après 5-6 passages. </li><li> Ne pas utiliser plus de 48 heures FAE. </li></ul></li><li> Immédiatement avant PGC plaquage, le milieu MEF doit être lentement retirée de la couche nourricière MEF. </li><li> Ensuite, ajoutez 0,5 ml / puits de pré-chauffé moyennes KO complété sur la couche d'alimentation du MEF. <ul><li> MEF support contient sérum fœtal bovin qui induit la différenciation des PGC. </li><li> Knockout moyennes doivent être complétées par des facteurs de croissance spécifiques specie immédiatement avant usage afin d'assurer l'activité du facteur de croissance. </li></ul></li><li> En utilisant la distribution symétrique, PGC plaque sur la couche d'alimentation du MEF. <ul><li> Si ces pièces sont trop proches, ils ont tendance à s'agréger et de faire des colonies denses qui s'attachent mal ou commencer différencier. </li><li> Des boîtes de culture doivent être étiquetés avec le nom de lignée cellulaire embryonnaire Germinal, le nombre de passages, et la date. </li></ul></li><li> Soigneusement, le transfert des boîtes de culture dans un incubateur à 37 ° C et 5% de CO 2. </li><li> Surveiller les cellules toutes les 24 heures. </li><li> Après 48 heures, retirer 250 ml de milieux de la haute hiérarchie de la culture pour éviter de perturber l'attachement de la colonie. Ensuite, ajoutez 250 ml de frais complété knock-out des médias (préchauffé à 37 ° C). </li><li> Après l'étape 7, attendre encore 48 heures, et ensuite, enlever complètement tous les médias et le remplacer par Fresh Media complétée knock-out (préchauffé à 37 ° C). Pour ce faire, deux tous les jours pendant 8-10 jours jusqu'à ce PGC forment des colonies. </li></ol> Partie 5: cellules embryonnaires Germinal <ol><li> Après 10 jours d'isolement PGC, embryonnaires colonies cellule germinale sont formées. </li><li> Lignées cellulaires embryonnaires germinales sont maintenues en vie par des passages manuels tous les 8-10 jours. Ils continuent de présenter une morphologie indifférenciée et expriment des marqueurs tels que la pluripotence alkalyne phosphatase, Oct-4, SSEA-1, et SOX-2 </li></ol> Remarques <ul><li> Des conditions stériles / aseptique sont essentiels dans la salle de culture. </li><li> Pour l'élaboration et à la culture, PGC sont traitées dans un cabinet Purificateur classe II de sécurité Bio. </li><li> Les incubations sont dans un 37 humidifié ° C et 5% de CO 2 incubateur. </li><li> Tous les médias et les réactifs sont filtrés avant utilisation dans un filtre de 0,2 um, conservés à 4 ° C, et pré-chauffé à 37 ° C avant utilisation. </li><li> Pendant les étapes de la dissection, tous les embryons et les tissus doivent être conservés sur glace. </li><li> Tous les flacons de réactifs sont décontaminés avec de l'éthanol avant de placer dans une armoire. </li><li> Utilisez des gants, des blouses de laboratoire, une infirmière et casquettes sont obligatoires. </li></ul> Conclusion Nous avons fourni une vidéo qui vous montre comment isoler, dégager, et la culture des cellules embryonnaires germinales à partir de 10.05 à 11.05 crêtes gonadiques embryons de souris DPC. L'isolement et la culture reproductibles à long terme de lignées cellulaires embryonnaires germinales fournit un fondement essentiel pour l'étude du développement embryonnaire précoce, les modèles génétiques et épigénétiques germinales, la formation des gonades, les effets environnementaux des organes environnants pendant le processus de développement de la gamétogenèse chez les embryons mâles et femelles, et la détermination des voies qui mène au cancer et l'infertilité. <img src="/files/ftp_upload/1635/1635figure1.jpg" alt="Figure 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1">

<ol><li>DeFelici, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDeFelici%2C+M+%22Cell+Biology%3A+A+laboratory+Handbook%22">Cell Biology: A laboratory Handbook</a>. 1, Second Edition, 73-85 (1998).</li>
<li>Donovan, P. J., De Miguel, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Turning+Germ+Cells+into+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Genetics+and+Development%22%5BJournal%5D)">Turning Germ Cells into Stem Cells.</a> Current Opinion in Genetics and Development. 13, 463-471 (2003).</li>
<li>Labosky, P. A., Hogan, B. L. M. Part 12: Mouse Primordial Germ Cells: isolation and in vitro culture. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLabosky%2C+PA+%22Molecular+embryology%3A+methods+and+protocols%22">Molecular embryology: methods and protocols</a>. Sharp, P. T., Mason, I. 97, Humana Press. Totowa, NJ. (1999).</li>
<li>Mc Laren, A., Southee, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Entry+of+Mouse+Embryonic+Germ+Cells+into+Meiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Entry of Mouse Embryonic Germ Cells into Meiosis.</a> Developmental Biology. 187, 107-113 (1997).</li>
<li>Yoshimizu, T., Obinata, M., Matsui, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stage-specific+tissue+and+cell+interactions+play+key+roles+in+mouse+germ+cell+specification%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Stage-specific tissue and cell interactions play key roles in mouse germ cell specification.</a> Development. 128, 481-490 (2001).</li>
<li>Zhang, J., Hhvorostov, I., Teitell, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+MEFs+to+Matrigel+I%3A+Passaging+hESCs+in+the+Presence+of+MEFs%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">From MEFs to Matrigel I: Passaging hESCs in the Presence of MEFs.</a> J Vis Exp. , (2008).</li>
</ol>

Cette recherche a été menée après examen et institutionnel de protection des animaux et utilisation comité (IACUC) l&#39;approbation de notre protocole de la souris # 08030 (Le rôle de l&#39;réactives de l&#39;oxygène-ROS dans le développement de la lignée germinale et la formation de tumeurs: Holding et l&#39;élevage de protocole) à la Mississippi State University.

Pince n ° 14 et 15, 35 mm bistouri, des ciseaux de dissection, champs chirurgicaux, savon antiseptique, une solution saline à 0,9%, de la gaze, contenant en mousse de glace, lame de rasoir, scalpel 35 mm, une pince fine n ° 4 et 5, l&#39;aiguille fine taquiner avec poignée, filtre à feuilles de papier, et a tiré des pipettes en verre.<br /<br /&gt; Équipement: stéréomicroscope à dissection, source de lumière Schott Fostec, microscope inversé, micropipette 10 et 200ul, centrifugeuse, le Cabinet de sécurité biologique.

l&#39;isolement et la dérivation de cellules germinales embryonnaires de souris

Isolation and Derivation of Mouse Embryonic Germinal Cells

La capacité des cellules embryonnaires germinales (EG) de se différencier en cellules germinales primordiales (PGC) et plus tard en gamètes premiers stades de développement est un modèle parfait pour répondre à nos hypothèses sur le cancer et l&#39;infertilité. Ce protocole montre comment isoler des cellules germinales primordiales gonades en développement dans les embryons 10/05 au 11/05 jours post-coïtum souris (DPC). Développer les crêtes gonadiques d&#39;embryons de souris (C57BL6J) ont été dissociées par une rupture mécanique avec de la collagénase, puis étalées en une couche de fibroblastes d&#39;embryon de souris d&#39;alimentation (MEF-CF1) qui était auparavant mitotiquement inactivé par la mitomycine C, en présence des médias à élimination directe et complétée par un inhibiteur de la leucémie Cell Factor Factor (LIF), facteur de croissance basique des fibroblastes (bFGF), et souches (SCF). L&#39;utilisation de ces méthodes optimisées pour l&#39;identification PCG, l&#39;isolement, et l&#39;établissement de conditions de culture permet les cultures à long terme des cellules EG depuis plus de 40 jours. Les lignes de cellules embryonnaires germinales montré phénotype embryonnaire et l&#39;expression des marqueurs utilisés commune de l&#39;état pluripotent. L&#39;isolement et la dérivation de cellules germinales dans la culture de fournir un outil pour comprendre leur développement in vitro et offrent la possibilité de surveiller les dommages cumulatifs aux niveaux génétiques et épigénétiques après l&#39;exposition au stress oxydatif.

La capacité des cellules embryonnaires germinales à se différencier en cellules germinales primordiales durant les stades de développement précoce est un modèle parfait pour répondre à nos hypothèses sur le cancer et l&#39;infertilité. Ce protocole montre comment isoler des cellules germinales primordiales gonades en développement en 10/05 à 11/05 jours post coïtum embryons de souris.

L&#39;isolement et la dérivation de cellules germinales embryonnaires de souris

La capacité des cellules germinales embryonnaires (EG) à se différencier en cellules germinales primordiales (PGC) puis, ultérieurement, en gamètes au cours du développement précoce...

Bonjour, je m'appelle Har Moreno du Laboratoire de génétique reproductive et de cellules souches de l'Université d'État du Mississippi. Bonjour, je m'appelle Clara St. Également du laboratoire de génétique reproductive et de cellules souches de l'Université d'État du Mississippi. Les cellules germinales précoces, ou PGC, sont les cellules progénitrices des ovocytes et des spermatozoïdes dans l'ovaire et le testicule respectivement.Dans les embryons de souris, les cellules germinales primitives migrent depuis l'intestin postérieur et traversent la crête génitale entre 8,5 et 9,5 jours. Après cela, les cellules germinales primitives atteignent la crête génitale entre 10,5 et 11,5 jours.Les cellules de soutien postumales commencent à former l'atteinte gonadique chez la femelle D. Les CS du pg migrent vers l'extrémité latérale du rein pour commencer à former l'atteinte gonadique femelle. En revanche, chez le mâle, les cellules germinales primitives migrent de chaque côté de la vessie.Pour commencer la formation. Les cellules germinales mâles d’alridge sont un excellent modèle de recherche pour étudier les voies développementales embryonnaires en présence de stress oxydatif, cause d’infertilité et de cancer. Alors, commençons.Aujourd'hui, nous allons vous montrer comment collecter et isoler les cellules de la crête génitale (PV Cs) à partir de crêtes gonadiques en développement chez des embryons de souris âgés de 10,5 à 11,5 jours. Les crêtes gonadiques sont dissociées par destruction mécanique puis implantées sur une couche de fibroblastes embryonnaires de souris. Après 10 jours de culture dans des conditions optimisées, des colonies germinales embryonnaires apparaîtront, présentant des phénotypes embryonnaires. De plus, après plusieurs passages, elles peuvent être identifiées par leur expression de marqueurs de pluripotence.Les matériaux suivants sont nécessaires pour cette étape de dissection stérile. Paquet contenant des champs stériles, des pinces, des ciseaux, des lames de rasoir, des savons antimicrobiens, des solutions salines, une boîte de Pétri remplie de PBS Pep sur de la glace et de la gaze, une souris femelle de souche C57BL/6 enceinte de 10,5 à 11 jours, l'animal est euthanasié par dislocation cervicale. Nettoyer l'abdomen avec un savon antimicrobien, puis le raser ensuite.Lavez l'abdomen avec des solutions salines. Séchez-le avec une compresse stérile. Recouvrez la souris avec un nouveau champ stérile.Réalisez une incision ventrale à l’aide d’une pince et de ciseaux anatomiques. Identifiez et retirez l’utérus entier de la cavité abdominale. Les embryons seront visibles à l’intérieur de l’utérus.Avec beaucoup de précaution. Passer à travers les ligaments encore attachés à la corne utérine. Terminer la dissection en effectuant une incision transversale le long du vagin.Transférez l'utérus dans une boîte de Pétri scellée avec du GPVS et maintenez-la sur de la glace. Séparez les tissus extra-embryonnaires des embryons buccaux. Utilisez un scalpel stérile et une pince.Transférez les embryons de bouche dans une nouvelle boîte de Pétri remplie de DPBS. Mesurez la longueur de l'embryon de bouche. Nous avons constaté que les tailles variaient selon l'âge de l'embryon.Par exemple, 8,5 jours après le couplage, la mesure moyenne est de six millimètres, 10,5 jours après le couplage, la mesure moyenne est de 11 millimètres et 12,5 jours après le couplage, la mesure moyenne est de 16 millimètres. Retirez leurs queues par extraction d'ADN. Les matériaux suivants sont nécessaires pour la dissection : microscope stéréo, hotte de sécurité biologique, PDS, scalpel stérile.Pince fine stérile, aiguille fine stérile pour éparpillement avec manche, disque de Petri, feuilles de papier filtre. Placer une feuille de papier filtre dans une boîte de Petri, puis déposer l'embryon buccal sur le papier filtre afin de sécher l'embryon et l'immobiliser pour la dissection. À l’aide d’un scalpel stérile, effectuer une incision transversale de l’embryon buccal au-dessus de l’origine du cordon ombilical sous un microscope stéréo.À l’aide de pinces fines stériles et d’une aiguille stérile à émietter, retirez les intestins et le foie afin que le système urinaire soit visible. La vessie se trouve dans un plan médial.L'embryon peut être identifié comme mâle car les ponts gonadiques se trouvent de chaque côté de la vessie. À l'aide de pinces fines stériles et d'une aiguille fine stérile, retirez la crête gonadique mâle droite en coupant les tissus qui la soutiennent. Utilisez la même procédure pour retirer la crête génitale mâle gauche.Transférez les deux crêtes génitales mâles dans une petite boîte de Pétri contenant du DPDS frais au microscope. Vous pouvez visualiser la crête gonadique mâle attachée au mésonephros. Les crêtes gonadiques mâles doivent apparaître de grande taille et de forme ovale sous un microscope stéréo.Retirer les intestins à l’aide d’une pince fine stérile et d’une aiguille fine stérile. Les reins sont situés latéralement dans la cavité abdominale, tandis que la vessie se trouve plus en position médiale et caudale par rapport aux reins. La crête génitale femelle diffère de la crête génitale mâle par sa morphologie et sa localisation anatomique.Les crêtes gonadiques femelles sont fermement attachées à l'extrémité latérale caudale du rein. À l'aide de pinces fines stériles et d'une aiguille fine stérile, retirez la crête gonadique femelle gauche en coupant les tissus qui l'attachent au rein.Répétez la même procédure pour retirer la crête gonadique droite femelle. Transférez les deux crêtes génitales femelles dans une petite boîte de Pétri contenant du PDS frais observé au microscope. Vous pouvez visualiser la crête gonadique mâle attachée au Neso Nera.Ces crêtes génitales femelles doivent présenter une forme allongée et être plus petites par rapport aux crêtes génitales mâles, en utilisant des aiguilles stériles, fines et pointues. Séparez les crêtes génitales femelles du mésonephros et des autres tissus somatiques à l’aide d’aiguilles stériles, fines et pointues. Séparez les crêtes génitales mâles du mésonephros et des autres tissus somatiques.Il est important de retirer le mésoderme néronal de la crête néphrotome, car il s'agit d'un tissu somatique qui envahira le processus de dérivation des cellules germinales primitives. Recueillir la crête génitale dans une goutte de 0,5 microlitre de DPVS frais contenant une solution de collagénase. Sous microscope stéréo, les tissus gonadiques sont découpés en petits morceaux à l’aide d’aiguilles stériles fines et pointues.Les boîtes de Pétri sont transférées dans un incubateur à 37 degrés Celsius pendant 15 minutes. Après 15 minutes, les tissus peuvent être dissociés par pipetage à l’aide de pipettes capillaires en verre étirées ayant des diamètres différents compris entre 40 et cent micromètres. Dissocier les fragments en aspirant et en expulsant plusieurs fois à l’aide de la pipette.Cela formera de petits amas. Ces petits agrégats sont lavés dans 0,5 microlitre de DPDX après le lavage. Ils sont ensuite transférés dans des cubes Eend à 2000 tr/min pendant cinq minutes.À température ambiante après la centrifugation, le surnageant est éliminé et le culot est redissous dans 0,5 millilitre de milieu knockout complémenté, préchauffé à 37 degrés Celsius pendant 24 heures. Avant cette étape, vous devez préparer une couche de cellules nourricières constituée de fibroblastes embryonnaires de souris inactivés par la mitomycine C, la lignée CCF, juste avant la mise en culture des cellules germinales primitives (PGC). Le milieu de culture doit être retiré de la couche de cellules nourricières préparée.Ensuite, ajouter par point des millilitres du milieu knockout supplémenté, préalablement réchauffé à 37 degrés Celsius, sur la couche nourricière de méth. Sous microscope stéréo et en utilisant une distribution symétrique, de petits agrégats de PT GC sont ensemencés sur les couches nourricières de méth. Si ces fragments sont trop proches, ils ont tendance à s’agréger et à former des colonies denses qui s’attachent mal ou commencent à différencier la culture.Les boîtes doivent être étiquetées avec le nom de la lignée de cellules germinales embryonnaires, le numéro de passage et la date. Transférez soigneusement les boîtes de culture dans un incubateur à 37 degrés Celsius et 5 % CO₂. Après 10 jours suivant l'isolement, vous pouvez identifier les colonies de cellules germinales embryonnaires en fonction de leur morphologie caractéristique. De plus, après le premier passage, elles peuvent être identifiées par leur expression de marqueurs de pluripotence tels que la phosphatase alcaline, Oct-4, SSEA-1 et Sox-2.Aujourd'hui, nous vous montrons comment isoler et cultiver des cellules germinales embryonnaires à partir de CPG chez la souris au stade 10,5-11,5 jours post-coïtum. La caractérisation des cellules germinales embryonnaires, en tant que précurseurs des cellules germinales, est essentielle pour comprendre les mécanismes liés à la gamétogenèse, à la fertilité et au cancer.Merci d'avoir regardé notre vidéo. Bonne chance dans votre expérience.

isolation-and-derivation-of-mouse-embryonic-germinal-cells

Research

Recherche

JoVE Journal

Biology

Biologie

Cette vidéo présente un protocole permettant d’isoler et de cultiver des cellules primaires du cortex cérébral à partir du télencéphale dorsolatéral d’embryons de souris.

Isolement et culture de cellules à partir de télencéphales dorsolatéraux d’embryons de souris

Au cours des dernières années, la formation de cellules germinales en utilisant des méthodes de culture in vitro a été démontrée en utilisant différents types de cellules souches somatiques. Cet article va présenter visuellement la différenciation des cellules souches dérivées de souris nouveau-nés aux cellules ovocyte comme au début.

Différenciation de la peau de souris nouveau-nés des cellules souches dérivées dans les cellules germinales comme<em&gt; In vitro</em

Nous avons développé un protocole pour générer des agrégats de cellules souches embryonnaires de souris qui présentent une auto-organisation, une brisure de symétrie et un allongement parallèle au développement axial. Cette technique permet d’étudier les processus de développement axial et de générer des types de cellules qui sont autrement difficiles à réaliser en culture monocouche.

Génération d&#39;agrégats de souris de cellules souches embryonnaires qui montrent la brisure de symétrie, la polarisation et le comportement collectif émergent<em&gt; In Vitro</em

Ce protocole présente un procédé pour effectuer, une seule cellule dans l'analyse quantitative in situ de l'expression des protéines à l'étude de la spécification lignée dans des embryons de pré-implantation de la souris. Les procédures nécessaires pour la collecte des blastocystes, entiers montage détection par immunofluorescence de protéines, l'imagerie d'échantillons sur un microscope confocal, et la segmentation nucléaire et l'analyse d'images sont décrites.

Analyse quantitative de l&#39;expression des protéines pour l&#39;étude de Lineage Spécification dans Souris préimplantatoire d&#39;embryons

cellules souches et progénitrices hématopoïétiques (HSPC) proviennent de (hemogenic) des cellules endothéliales spécialisées au cours du développement, mais on sait peu sur le processus par lequel certaines cellules endothéliales spécifient pour devenir la formation du sang. Nous démontrons une méthode basée sur la cytométrie de flux permettant l'isolement simultané des cellules endothéliales hemogenic et HSPC de tissus embryonnaires murines.

Isolement des cellules embryonnaires murines Hemogenic endothéliales

Le protocole décrit ici détaille l’induction d’un programme hémogénique dans des fibroblastes embryonnaires de souris via la surexpression d’un ensemble minimal de facteurs de transcription. Cette technologie pourrait être transposée au système humain afin de fournir des plateformes pour l’étude future de l’hématopoïèse, des maladies hématologiques et de la greffe de cellules souches hématopoïétiques.

Reprogrammation fibroblastes embryonnaires de souris avec les facteurs de transcription pour induire un programme Hemogenic

Cet article décrit un protocole pour efficacement dérivent et la culture de lignées de cellules souches pluripotentes embryonnaires de souris au stade de blastocyste.

Dérivation de lignées de cellules souches provenant d’embryons préimplantatoires souris

Ici, nous présentons une nouvelle technique microchirurgicale pour isoler des cellules souches neurales de l’éminence E13 souris embryon ganglionnaire.

Isolement et Culture des embryons de souris des cellules souches neurales

Ici, nous présentons une méthode simple et efficace pour isoler les cellules germinales méiotiques et post-méiotiques vivantes des testicules adultes de souris. À l’aide d’une faible cytotoxicité, d’un colorant liant l’ADN violet et d’un tri cellulaire activé par fluorescence, on peut isoler des populations de cellules spermatogéniques hautement enrichies pour de nombreuses applications en aval.

Isolement des cellules spermatogéniques murines à l’aide d’un colorant liant à l’ADN perméable à la cellule violette

Cet article vise à démontrer l’utilisation de cellules souches embryonnaires haploïdes parthénogénétiques comme substitut au sperme pour la construction d’embryons semi-clonés.

Application des cellules souches embryonnaires haploïdes parthénogénétiques de souris comme substitut du sperme

Cet article établit un pipeline pour des suspensions de cellules uniques et de noyaux de haute qualité d’embryons de souris gaztrulants pour le séquençage de cellules uniques et de noyaux.

Séquençage de l’ARN unicellulaire d’embryons entiers de souris mutantes : de l’épiblaste à la fin de la gastrulation

Découvrez l'isolement des cellules germinales embryonnaires de souris à 10,5-11,5 jours post coïtum. Cette méthode permet d'étudier la différenciation cellulaire et ses implications pour la recherche sur l'infertilité et le cancer.

L'isolement et la dérivation de cellules germinales embryonnaires de souris

Explorer plus de vidéos