Modélisation colite murin en utilisant du sulfate de sodium Dextran (DSS)

Les souris reçoivent du DSS à 3 % à volonté pendant quatre jours. Alors que le poids corporel ainsi que la présence de diarrhée et de sang dans les selles sont enregistrés quotidiennement, le DSS est remplacé par de l'eau stérilisée à l'autoclave après le quatrième jour. Après trois jours d'eau, les souris sont euthanasiées et leurs côlons sont prélevés.

Les côlons sont mesurés et pesés. Ensuite, les côlons sont soit enroulés en forme de « rouleaux suisses », soit façonnés en saucisses, puis examinés au microscope. Cet article vidéo démontrera la récolte et le traitement des côlons dans un modèle murin de colite.

Cette procédure est utilisée pour étudier la colite dans le laboratoire du Dr Christopher Williams du Département de biologie du cancer de l'Université Vanderbilt, avant le début du traitement par le sulfate de dextrane sodique. Des poids de référence sont obtenus tout au long de l'expérience. Des poids quotidiens sont relevés après avoir pesé les souris, puis on prépare une solution de sulfate de dextrane sodique (DSS) à 3 % poids par volume dans l'eau.

Le DSS doit être de faible masse moléculaire pour que ce modèle soit efficace ; préparez suffisamment de solution de DSS pour remplir une bouteille d'eau pour chaque cage de souris, puis filtrez la solution à l'aide d'un filtre en acétate de cellulose de 0,45 micromètre. Remplacez la bouteille d'eau de boisson dans la cage des souris par une bouteille contenant une solution de DSS à 3 %. Si votre établissement utilise un système d'arrosage automatisé, placez des embouts d'exclusion sur les becs verseurs afin de garantir que les souris n'aient accès à aucune autre source d'eau.

Après quatre jours, les souris sont pesées à nouveau afin de quantifier les conséquences systémiques de la colite. La perte de poids est fréquente en cas de lésion sévère, mais peut ne pas être apparente pendant encore plusieurs jours le jour même. Au jour quatre, remplacez la solution de DSS par de l'eau pendant trois jours supplémentaires pour permettre une certaine récupération de l'épithélium colique.

Trois jours plus tard, au jour sept, les souris sont à nouveau pesées. Le côlon peut alors être prélevé sur les souris euthanasiées, comme indiqué dans la section suivante. Pour prélever le côlon, exposez la face ventrale de la souris euthanasiée afin d'assurer un accès sans entrave à l'abdomen.

Humidifiez complètement l'abdomen avec de l'éthanol à 70 %. Saisissez la ligne médiane de l'abdomen avec une pince à tissus et soulevez-la. Tendez ainsi la peau à l’aide de ciseaux fins.

Inciser l'abdomen pour exposer le contenu abdominal. Prolonger l'incision jusqu'à l'extrémité du processus xiphoïde au niveau de la ligne médiane, puis poursuivre le long de l'aspect inférieur des bords costaux de manière bilatérale. Identifier l'intestin grêle, le caecum et le côlon.

Disséquez soigneusement le côlon en le séparant du mésentère environnant. Ensuite, sectionnez le côlon pour l'abaisser vers le pelvis afin de libérer le côlon distal du rectum.

Il convient de faire attention pour ne couper aucune artère ni veine. De plus, sachez que le côlon peut se déchirer facilement. Retirez donc délicatement le côlon du mésentère.

Transecter le côlon au niveau de la marge de séquelle colique afin de libérer le côlon proximal. Retirer le côlon en totalité et, à l’aide d’une sonde d’alimentation de calibre 20 et d’une seringue de 10 millilitres, intuber et rincer le côlon avec du PBS glacé jusqu’à ce que l’EIT soit complètement débarrassé des selles. Il est important de maintenir l’orientation correcte du côlon en gardant l’extrémité distale du côlon la plus proche de vous.

Commencez par mesurer la longueur du côlon à l’aide d’un pied à coulisse numérique. La longueur du côlon constitue un autre indicateur de la gravité de la lésion. La colite augmente l’œdème et raccourcit la longueur totale du côlon.

À ce stade, les côlons prélevés peuvent être traités soit sous forme de saucisses pour une analyse macroscopique, soit en rouleau suisse pour une analyse histologique de la colite aiguë. Nous démontrerons ces techniques dans les sections suivantes pour traiter le côlon sous forme de saucisse. Pour l'analyse macroscopique de l'ensemble du côlon, il est important de maintenir l'orientation correcte du côlon. Par conséquent, gardez l'extrémité distale du côlon la plus proche de vous.

Coupez deux morceaux de suture non résorbable, l'un d'environ un pouce de longueur et l'autre de deux pouces de longueur. Utilisez le morceau de suture de deux pouces pour ligaturer l'extrémité distale du côlon aussi près que possible de la marge tout en maintenant un bon étanchéité. Ensuite, insérez une aiguille d'alimentation de calibre 20 contenant cinq millilitres de formol tamponné au phosphate à 10 % dans l'extrémité proximale du côlon.

Faire un nœud lâche avec le morceau restant de suture immédiatement en position proximale par rapport à la boule de l'aiguille d'alimentation. Saisir ensuite fermement le côlon au niveau de la boule de l'aiguille d'alimentation et injecter une quantité suffisante de formol afin de garantir le gonflement du côlon. Serrer le nœud de la suture en retirant l'aiguille d'alimentation, laissant ainsi le côlon gonflé par l'injection.

En tant que saucisse, remplir un tube conique de 15 millilitres avec du formol tamponné à 10 %, phosphate, et étiqueter le tube. Placer le côlon dans le tube et fixer pendant 24 heures. Après 24 heures, verser le formol dans un contenant approprié pour déchets et le remplacer par de l'éthanol à 70 % pendant encore 24 heures.

Les côlons peuvent être conservés indéfiniment à température ambiante dans de l'éthanol à 70 %. Lorsque vous êtes prêt à analyser le côlon, retirez-le du tube conique. Coupez les ficelles à chaque extrémité à l’aide d’un scalpel en prenant soin de ne pas endommager le côlon.

Rappelez-vous que l'extrémité distale possède le morceau de ficelle le plus long. Incisez longitudinalement le côlon de l'extrémité distale vers l'extrémité proximale afin d'obtenir une longue lamelle. Le côlon peut désormais être observé au microscope stéréoscopique.

Couper le côlon longitudinalement et l’étaler comme une feuille plate. Le roulage du côlon nécessite deux paires de forceps et une technique à deux mains. Saisir les deux bords latéraux de la marge distale du côlon avec les forceps, puis rouler successivement le côlon en faisant pivoter et en relâchant les forceps en progressant vers la marge proximale, formant ainsi une spirale en trois dimensions, ou « Swiss roll ».

Si le côlon adhère au papier Watman, humidifier le papier et le côlon avec une petite quantité de PBS pour en maintenir la forme. Saisir fermement le rouleau avec une pince et le sectionner à l’aide d’une aiguille de calibre 27 et demi. Maintenir le rouleau en place en courbant l’aiguille lorsqu’elle sort du rouleau.

Maintenant, placez le rouleau dans une cassette pour tissus étiquetée et mettez la cassette dans un bocal contenant du formol tamponné à 10 %. Laissez à température ambiante pendant 24 heures pour fixer le tissu. Après 24 heures, versez le formol et remplacez-le par de l’éthanol à 70 % pendant quatre heures supplémentaires.

Les côlons peuvent être conservés indéfiniment à température ambiante dans de l'éthanol à 70 %. Ce modèle permet au chercheur d'obtenir, de fixer et d'analyser les côlons, ce qui autorise l'analyse de la gravité de la colite. Pour une analyse macroscopique de l'ensemble du côlon, celui-ci peut être traité comme une saucisse qui est perfusée avec du formol et complètement dilatée.

La saucisse ouverte doit être à plat. Si la méthode de la saucisse a été correctement réalisée, le côlon fixé sera dilaté et toute la surface muqueuse pourra être facilement manipulée et observée au microscope stéréoscopique. Pour l'analyse histologique, le côlon peut être préparé selon la technique du rouleau suisse.

Le rouleau est fixé à l'aide d'une aiguille et placé dans une cassette histologique pour la fixation. Lorsque le rouleau est coupé et monté, il doit former une coupe représentative de tout le côlon s'il est correctement enroulé ; des sections du rouleau suisse peuvent être colorées à l'hématine et à l'ASIN afin de déterminer l'importance des lésions coliques. N'oubliez pas que l'extrémité distale du côlon se trouve au centre du rouleau sur la lame.

Dans cet exemple, l'inflammation et les lésions cryptiques sont apparentes dans le côlon traité au DSS par rapport à un témoin traité à l'eau. Nous venons de vous montrer comment récolter et traiter les côlons à partir d'un modèle murin de colite aiguë. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important d'être bien organisé avant la mise à mort de l'animal.

Les souris, par exemple, disposent de tous les tubes et cassettes étiquetés pour chaque souris, ainsi que de tous les outils et réactifs facilement accessibles. En outre, tenez des registres détaillés du poids des souris et de la longueur du côlon. Enfin, assurez-vous d'avoir prévu suffisamment de temps pour le traitement.

Il faut généralement 15 minutes par souris pour un débutant et de six à huit minutes pour une personne plus expérimentée dans cette technique.