Modélisation colite murin en utilisant du sulfate de sodium Dextran (DSS)

Les souris reçoivent 3 % de DSS à la libido pendant quatre jours. Alors que le poids et la présence de diarrhée et de sang fécal sont enregistrés quotidiennement, le SCT est remplacé par de l’eau d’autoclave après le quatrième jour. Après trois jours sur l’eau, les souris sont euthanasiées et leur côlon est retiré.

Les deux-points sont mesurés et pesés. Les côlons sont ensuite transformés en petits pains suisses ou en saucisses et examinés au microscope. Cet article vidéo démontrera le prélèvement et le traitement des côlons dans un modèle murn de colite.

Cette procédure est utilisée pour étudier la colite dans le laboratoire du Dr Christopher Williams du Département de biologie du cancer de l’Université Vanderbilt avant de commencer le traitement au sulfate de dextrine sodique. Les poids de référence sont obtenus tout au long de l’expérience. Les poids quotidiens sont pris après que les souris ont été pesées, ce qui fait un poids de 3 % par volume, une solution de sel de sodium de sulfate de dextrine ou DSS dans l’eau.

Le DSS doit être d’un faible poids moléculaire pour que ce modèle soit efficace, produire suffisamment de solution DSS pour remplir une bouteille d’eau pour chaque cage de souris et filtrer la solution avec un filtre en acétate de cellulose de 0,45 micromètre. Remplacez la bouteille d’eau potable dans la cage de la souris par une bouteille contenant une solution à 3 % de DSS. Si votre établissement utilise un système d’arrosage automatisé, placez des conseils d’exclusion sur les becs d’arrosage pour vous assurer que les souris n’ont accès à aucune autre source d’eau.

Après quatre jours, les souris sont pesées à nouveau pour quantifier les conséquences systémiques de la colite. La perte de poids est fréquente avec des blessures graves, mais peut ne pas être apparente avant plusieurs jours le même jour. Le quatrième jour, remplacez la solution de SSD par de l’eau pendant trois jours supplémentaires pour permettre une certaine récupération de l’épithélium du côlon.

Trois jours plus tard, le septième jour, les souris sont à nouveau pesées. Le côlon peut ensuite être récolté sur les souris euthanasiées, comme indiqué dans la section suivante. Pour prélever le côlon, exposez la face ventrale de la souris euthanasiée afin d’assurer un accès libre à l’abdomen.

Mouillez complètement l’abdomen avec de l’éthanol à 70 %. Saisissez la ligne médiane de l’abdomen avec des pinces à tissus et élevez-la. Fixant ainsi la peau à l’aide de ciseaux à pointe fine.

Inciser l’abdomen pour exposer le contenu abdominal. Étendez l’incision jusqu’à l’extrémité de l’apophyse xiphoïde sur la ligne médiane, puis étendez-la le long de la face inférieure des marges costales bilatéralement. Identifiez l’intestin grêle, le caecum et le côlon.

Disséquez soigneusement, coupez le côlon du mésentère environnant. Après cela, transectez le côlon et approfondissez le bassin pour libérer. Le côlon distal du rectum.

Des précautions doivent être prises pour qu’aucune artère ou veine ne soit coupée. Sachez également que le côlon peut se déchirer facilement. Retirez donc délicatement le côlon du mésentère.

Transectez le côlon à la marge de la suite de Colona pour libérer le côlon proximal. Retirez le côlon et le total à l’aide d’une aiguille d’alimentation de calibre 20 et d’une seringue de 10 millilitres, intubez et rincez le côlon avec du PBS glacé jusqu’à ce que l’EIT soit complètement débarrassé des selles. Il est important de maintenir la bonne orientation du côlon en gardant l’extrémité distale du côlon la plus proche de vous.

Commencez par mesurer la longueur du côlon à l’aide d’un pied à coulisse numérique. La longueur du côlon est un autre indicateur de la gravité de la blessure. La colite augmente l’œdème et raccourcit la longueur totale du côlon.

À ce stade, les côlons récoltés peuvent être soit transformés en saucisses pour une analyse macroscopique, soit transformés en rouleau suisse pour l’analyse histologique de la colite aiguë. Nous démontrerons ces techniques dans les sections suivantes pour traiter le côlon comme une saucisse Pour l’analyse macroscopique de l’ensemble du côlon, il est important de maintenir l’orientation correcte du côlon. Par conséquent, gardez l’extrémité distale du côlon la plus proche de vous.

Coupez deux morceaux de suture non résorbables, l’un d’environ un pouce de longueur et l’autre de deux pouces de longueur. Utilisez le morceau de suture de deux pouces pour attacher l’extrémité distale du côlon aussi près que possible de la marge tout en maintenant une bonne étanchéité. Ensuite, placez une aiguille d’alimentation de calibre 20 contenant cinq millilitres de phosphate de formol tamponné à 10 % dans l’extrémité proximale du côlon.

Attachez sans serrer le morceau de suture restant immédiatement à proximité du bulbe de l’aiguille d’alimentation. Maintenant, saisissez fermement le côlon au niveau du bulbe de l’aiguille d’alimentation et infusez une quantité suffisante de formol pour vous assurer que le côlon est dilaté. Serrez le nœud dans la suture pendant que vous retirez l’aiguille d’alimentation, laissant ainsi le côlon élargi infusé.

En tant que saucisse, remplissez un tube conique de 15 millilitres avec 10 % tamponné, formel et phosphate, et étiquetez le tube. Placez le côlon dans le tube et fixez pendant 24 heures. Après 24 heures, versez le formin dans un conteneur à déchets approprié et remplacez-le par de l’éthanol à 70 % pendant 24 heures supplémentaires.

Les deux-points peuvent être conservés indéfiniment dans de l’éthanol à 70 % à température ambiante. Lorsque vous êtes prêt à analyser le côlon, retirez-le du tube conique. Coupez les ficelles à chaque extrémité avec un scalpel en faisant attention de ne pas endommager le côlon.

N’oubliez pas que l’extrémité distale a le plus long morceau de ficelle. Coupez le côlon longitudinalement de l’extrémité distale à l’extrémité proximale afin qu’il forme une longue feuille. Le côlon peut maintenant être observé au microscope à dissection.

Coupez le côlon longitudinalement et disposez-le en une feuille plate. Le roulement du côlon nécessite deux paires de pinces et une technique à deux mains. Saisissez les deux bords latéraux de la marge distale du côlon avec une pince pour faire rouler séquentiellement le côlon en tournant et en relâchant la pince en procédant vers la marge proximale, générant ainsi une spirale avec une troisième dimension ou un rouleau suisse.

Si le côlon adhère au papier watman, mouillez le papier et le côlon avec une petite quantité de PBS pour maintenir la forme. Saisissez fermement le rouleau à l’aide d’une pince et transectez avec une aiguille de calibre 27 et demi. Fixez le rouleau en pliant l’aiguille à la sortie du rouleau.

Maintenant, placez le rouleau dans une cassette de tissu étiquetée et placez la cassette dans un pot de phosphate de formol tamponné à 10 %. Laissez-le à température ambiante pendant 24 heures pour fixer le tissu. Après 24 heures, versez le formol et remplacez-le par de l’éthanol à 70 % pendant quatre heures supplémentaires.

Les deux-points peuvent être conservés indéfiniment dans de l’éthanol à 70 % à température ambiante. Ce modèle permet au chercheur d’obtenir, de fixer et d’analyser les côlons, permettant ainsi l’analyse de la gravité de la colite. Pour l’analyse macroscopique de l’ensemble du côlon, le côlon peut être transformé comme une saucisse infusée de formol et complètement expansée.

Le saucisson ouvert doit reposer à plat. Si la méthode de la saucisse a été effectuée correctement, le côlon fixe sera dilaté et toute la surface de la muqueuse pourra être facilement manipulée et visualisée sous le microscope de dissection. Pour l’analyse histologique, le côlon peut être traité comme un rouleau suisse.

Le rouleau est fixé à l’aide d’une aiguille et placé dans une cassette de tissus pour la fixation. Lorsque le rouleau est coupé et monté, il devrait former une tranche représentative de l’ensemble du côlon s’il est roulé correctement, des sections du rouleau suisse peuvent être colorées avec de l’hématine et de l’ASIN afin de déterminer l’étendue des lésions du côlon. Rappelez-vous que l’extrémité distale du côlon se trouve au centre du rouleau sur la lame.

Dans cet exemple, l’inflammation et les dommages à la crypte sont apparents dans le côlon traité au DSS par rapport à un témoin traité à l’eau. Nous venons de vous montrer comment prélever et traiter les côlons à partir d’un modèle murin de colite aiguë. Lorsque vous effectuez cette procédure, il est important que vous soyez bien organisé avant de sacrifier.

Les souris, par exemple, ont tous les tubes et cassettes étiquetés pour chaque souris et tous les outils et réactifs facilement disponibles. De plus, tenez des registres détaillés du poids de la souris et de la longueur du côlon. Enfin, assurez-vous d’avoir alloué suffisamment de temps pour le traitement.

Cela prend généralement 15 minutes par souris pour un novice et six à huit minutes pour quelqu’un de plus expérimenté dans cette technique.