Utilisation du système d'électroporation Gene Pulser MXcell à transfecter des cellules primaires à haut rendement

L'objectif général de ce protocole est d'identifier les conditions optimales d'électroporation pour transfecter des lignées cellulaires primaires en utilisant des fibroblastes embryonnaires de souris ou des mfs. À titre d'exemple, les cellules MF et l'acide nucléique choisi sont chargés dans une plaque d'électroporation 96 puits fixée au système cellulaire Gene Pulser MX, ce qui permet de tester plusieurs conditions d'électroporation lors d'un seul essai. Pour les expériences d'optimisation, les cellules sont cultivées après électroporation, puis analysées pour déterminer l'efficacité de transfection.

À l'aide de la microscopie épifluorescente et de la cytométrie en flux, les conditions d'électroporation les plus efficaces peuvent ensuite être sélectionnées pour les transfections futures. Bonjour, je suis Adam McCoy, scientifique principal au sein de la division d'expression génique chez BioRad Laboratories. Aujourd'hui, nous allons vous montrer une procédure permettant d'identifier facilement les meilleures conditions d'électroporation pour transfecter des lignées cellulaires primaires.

Nous utilisons cette procédure dans notre laboratoire pour étudier l'expression génique dans ces cellules. Aujourd'hui, j'utiliserai trois nombres de passage différents de MEF, ou fibroblastes embryonnaires de souris. J'utilise des cultures de nombres de passage différents pour deux raisons.

Tout d'abord, je vais montrer à quel point la santé cellulaire est importante : avec des lignées cellulaires primaires, même quelques jours supplémentaires en culture peuvent influencer l'efficacité de la transfection. Ensuite, je souhaite démontrer que le processus d'identification des meilleures conditions reste identique, même si l'efficacité de la transfection diminue avec les cellules plus âgées. Votre expérience impliquera probablement des cellules d'un âge unique.

Vous pouvez suivre la même procédure avec votre propre conception expérimentale. Si vous souhaitez comparer l'expression génique entre des cellules témoins et traitées, vous pouvez d'abord déterminer les meilleures conditions, puis réaliser votre expérience en utilisant les conditions que vous avez identifiées. Ou bien, vous pouvez effectuer votre optimisation et votre expérience simultanément.

Comme je vais le démontrer aujourd'hui, j'utiliserai un plasmide codant pour la GFP afin d'évaluer l'efficacité de la transfection par cytométrie en flux. Toutefois, la procédure d'électroporation serait identique même si vous faites autre chose, par exemple introduire de l'irna et analyser l'expression génique par PCR en temps réel. Commençons donc.

Les fibroblastes embryonnaires de souris, ou mets, utilisés dans ce protocole sont des cellules adhérentes. La première étape consiste donc à les détacher du fond du flacon en utilisant des protocoles standards de culture tissulaire impliquant la trypsination. Une fois les cellules détachées du flacon, neutralisez la trypsine avec un milieu contenant du sérum et recueillez les cellules dans des tubes coniques de 50 millilitres.

Une fois les cellules recueillies, effectuez une centrifugation après que les cellules aient formé un culot. Elles doivent être lavées par resuspension, en les redispersant dans un volume connu de PBS. Après une resuspension complète, déterminez le nombre de cellules, sachant qu'une concentration d'un million de cellules par millilitre sera nécessaire pour les expériences d'électroporation.

Calculez le nombre approprié de cellules en fonction du décompte cellulaire et transférez-les dans un tube propre. Faites centrifuger davantage pour former un culot cellulaire. Ensuite, retirez soigneusement le surnageant.

Resuspendre les cellules dans du tampon d'électroporation à une concentration d'un million de cellules par millilitre et ajouter 20 microgrammes par millilitre de plasmide. Les plaques sont divisées en 96 puits, avec des colonnes numérotées de 1 à 12 et des lignes désignées de A à H ; chaque groupe de quatre puits, ou ensemble de puits, partage une paire de plaques électrodes, de sorte que les cellules dans ces puits reçoivent la même impulsion. Par exemple, les puits A1, B1, C1 et D1 sont électriquement connectés au sein d'un même ensemble de puits et reçoivent donc tous la même impulsion.

Le prochain ensemble de quatre puits, deux, A, B, C et D, recevraient tous la deuxième impulsion lorsque le protocole est lancé, même si les paramètres peuvent être identiques. La plaque d'électroporation 96 puits est également configurée de manière à diviser la moitié supérieure et inférieure de la plaque. Ainsi, les puits un E, un F, un G et un H situés dans la partie inférieure de la plaque reçoivent tous une impulsion, mais celle-ci est distincte de l'impulsion reçue par les puits un, A, B, C et D situés en haut.

Dans cette expérience, seule la moitié de la plaque sera utilisée. Les trois premiers puits de chaque série de puits contiennent des cellules d'âges différents. Les cellules de la rangée supérieure, rangée A, ont été repiquées cinq fois.

Les cellules de la rangée B ont été repiquées neuf fois et celles de la rangée C ont été repiquées 13 fois. La rangée D contient uniquement du tampon d'électroporation avant l'électroporation. Il est conseillé de vérifier votre protocole afin de s'assurer que les paramètres sont corrects.

Ce protocole délivrera six impulsions à décroissance exponentielle suivies de six impulsions en onde carrée. Les impulsions à décroissance exponentielle augmentent de 200 volts à 450 volts et utilisent toutes uniquement 350 micro belettes. En raison de la faible résistance du tampon de gène ou de l'électroporation utilisé.

Les impulsions en onde carrée varient à la fois en tension et en durée d'impulsion. Le réglage de la capacité de l'appareil doit être adapté à la conductivité du mélange d'électroporation. Si l'on utilise un tampon à plus haute résistance pour l'électroporation, comme le DMEM, la même gamme de tension peut être utilisée, mais avec une capacité plus élevée, telle que 950 microfarads pour les impulsions à décroissance exponentielle.

Si la capacitance optimale du tampon que vous utilisez n'est pas connue, vous devrez également faire varier la capacitance dans les conditions d'électroporation que vous testez. La prochaine étape consiste à charger 150 microlitres de mélange cellules-plasmide dans chaque puits utilisé pour cette expérience. Le quatrième puits de chaque série de puits utilisée est rempli de tampon d'électroporation.

Après avoir chargé la plaque, placez-la dans la chambre de la plaque MXL et fermez le couvercle. Ensuite, appuyez sur impulsion pour électroporater les cellules. L'électroporateur délivre les impulsions électriques séquentiellement à chaque puits selon les conditions spécifiées dans le protocole choisi.

Il faut quelques secondes pour électroporer toutes les cellules. Une fois l'impulsion terminée, retirez la plaque de la chambre à plaque et mélangez. Transférez les cellules de chaque puits dans une boîte de culture contenant un milieu de culture préchauffé.

Ces més sont cultivés dans du DMEM supplémenté avec 10 % de FBS. Les échantillons témoins qui n'ont pas été électroporés sont prélevés à partir du mélange plasmidique cellulaire restant et ajoutés à des boîtes de culture contenant la culture préchauffée. Milieu de même composition que celui utilisé avec les cellules électroporées. Enfin, agiter en tournant.

Ensuite, tapez doucement sur la plaque pour répartir les cellules avant de l'incuber pendant 24 heures à 37 degrés Celsius, 5 % de dioxyde de carbone, puis d'analyser l'efficacité de la transfection et d'identifier les conditions d'électroporation les plus adaptées à votre expérience. Une fois les conditions d'électroporation optimales déterminées, deux méthodes d'électroporation sont disponibles pour les expériences ultérieures. Le chercheur peut soit continuer à traiter les cellules dans des plaques de 96 puits, soit traiter les cellules dans des cuvettes, un échantillon à la fois.

Les cuvettes ne peuvent traiter qu'un échantillon à la fois et nécessitent un volume quatre fois supérieur à celui requis pour un puits des plaques 96 puits, mais les cuvettes individuelles sont moins coûteuses et faciles à utiliser lorsque seul un petit nombre d'échantillons est nécessaire. Le système Gene Pulse ou MX Cell est conçu pour permettre d'utiliser les mêmes paramètres d'électroporation dans les plaques et les cuvettes cette fois-ci. Utilisez le MXL Shock Pod pour les cuvettes au lieu de la chambre de plaque.

Débranchez la chambre de plaque de l'arrière de l'appareil et branchez le module de choc. Étant donné que le module de choc ne délivre que l'impulsion programmée pour le jeu de puits A, B, C, D un, il peut être nécessaire de sélectionner un programme différent. Pour sélectionner un programme précédemment enregistré, appuyez sur accueil.

Ensuite, sélectionnez l'option trois, les protocoles utilisateur. Si vous êtes déjà dans le dossier utilisateur approprié, appuyez sur Entrée pour sélectionner les protocoles utilisateur et faites défiler vers le bas. Pour mettre en surbrillance le bon programme, appuyez sur Entrée pour sélectionner ce programme.

L'appareil est désormais prêt. Maintenant que le programme est sélectionné, préparez les cuvettes. Le mélange de plasmide et de MEF est préparé de la même manière que précédemment indiqué.

Chargez chaque vét de 0,4 centimètre avec le même volume utilisé pour un ensemble complet de puits. Dans les plaques de 96 puits, un ensemble de puits correspond à quatre puits, et 150 microlitres de tampon ou de mélange cellulaire étaient utilisés par puit, soit 600 microlitres du mélange cellulaire plasmidique par vét.

Placez ensuite la pipette dans la chambre de choc du dispositif, appuyez sur impulsion pour délivrer le choc électrique aux cellules. Après électroporation, procédez comme dans la méthode de mise en plaque : mélangez les cellules, puis transférez des aliquotes dans des plaques de culture cellulaire remplies de milieu préchauffé en guise de témoin. Pour les puits qui n'ont pas subi d'électroporation, agitez doucement la plaque en la faisant tourner et tapez dessus.

Ensuite, laisser les cellules se recouvrer pendant 24 heures à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone avant d'analyser l'efficacité de transfection après avoir transfecté les cellules et leur avoir permis de se recouvrer. Analyser l'efficacité de transfection de manière qualitative à l’aide de la microscopie en épifluorescence et de manière quantitative par cytométrie en flux. Les cellules ayant été électroporées avec succès et exprimant maintenant le gène GFP apparaissent en vert en microscopie en épifluorescence ; voici un résultat typique de réussite. L’observation des cellules en contraste de phase permet de visualiser à la fois les cellules transfectées et non transfectées.

Les cellules présentées ici ont été exposées à une impulsion d'électroporation à la tension la plus faible, de 200 volts. Les cellules sont en grande partie confluentes en raison de la forte densité cellulaire. Le même champ de vision en fluorescence épifluorescence montre qu'un certain nombre de cellules expriment le marqueur GFP, mais celles-ci ne représentent qu'un faible pourcentage des cellules visibles sur l'image précédente prise à 250 volts.

Le nombre total de cellules vivantes observées en contraste de phase diminue légèrement en fluorescence épiscopique. On peut constater que le nombre de cellules exprimant la GFP a augmenté à la tension la plus élevée appliquée, soit 375 volts. Il y a moins de cellules vivantes visibles ; toutefois, un grand pourcentage des cellules restantes exprime la GFP.

La condition optimale dépend du plan expérimental. Dans certaines expériences, le plus grand nombre de cellules transfectées peut être optimal. Dans d'autres expériences, le pourcentage de transfection le plus élevé pourrait être le meilleur.

Nous nous intéressons au pourcentage de cellules GFP positives dans chaque condition et à la manière dont ces pourcentages varient en fonction de l'âge cellulaire. La cytométrie peut fournir des informations quantitatives sur les résultats de transfection obtenus dans chacune des différentes conditions d'électroporation. Sont indiqués ici les pourcentages de cellules GFP positives au cours du passage.

Cinq cellules. Pour chacune des 12 conditions d'électroporation, le pourcentage maximal de transfection était d'environ 80 % avec la décroissance exponentielle de tension la plus élevée. La condition d'impulsion numéro six et 70, avec l'impulsion carrée la plus forte testée (condition 12), a été appliquée après que les cellules eurent été passées neuf fois avant l'électroporation.

Le profil global du pourcentage de transfection est presque identique, mais avec une très légère diminution des pourcentages de transfection observés. Voici les pourcentages de cellules GFP dans les cellules au passage 13, qui montrent une baisse marquée du pourcentage de transfection par rapport aux cellules plus jeunes. Les pourcentages de transfection les plus élevés étaient d'environ la moitié de ceux obtenus avec les cellules plus jeunes, soulignant l'importance d'utiliser des cellules saines aussi peu de temps que possible après leur isolement.

J'ai simplement montré comment utiliser le système d'électroporation MXL pour déterminer les conditions optimales d'électro-probation des cartes ou d'autres lignées cellulaires primaires. Lors de cette procédure, il est important de se souvenir d'utiliser des cellules saines aussitôt que possible après leur isolement et d'appliquer des conditions d'électroporation adaptées au tampon d'électroporation. Voilà donc tout.

Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.