Name: Mismatch repair imagerie et les réponses cellulaires aux dommages de lADN dans /em (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-02-08T17:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 28 s
Description: Découvrez l'imagerie en temps réel des complexes de réparation de l'ADN dans Bacillus subtilis en utilisant des fusions protéiques GFP. Cette méthode permet d'observer les dynamiques de la réparation des mésappariements dans les cellules vivantes.

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Les auteurs tiennent à remercier les Drs. Philina S. Lee et Alan D. Grossman pour un premier entraînement LAS en microscopie à fluorescence. Les auteurs remercient également les Drs. Mélanie Berkmen et Hajime Kobayashi de l&#39;aide et des conseils pour l&#39;imagerie. Ce travail a été soutenu par des fonds de démarrage du Collège de Littérature, Sciences &amp; Arts et du ministère de la biologie moléculaire, cellulaire et du développement à l&#39;Université du Michigan.

Cultures en croissance de cellules pour la microscopie 1. Un ou deux jours avant l'imagerie, de préparer le B. subtilis souche contenant la protéine de fusion traductionnelle vous souhaitez visualiser. Tours de première instance de 1A et 1B étapes seront nécessaires pour déterminer quelle condition la croissance fournit les meilleures images de vos contraintes. Dans la plupart des cas, les cellules doivent être imagés pendant la phase de croissance exponentielle. <ol class="ualpha"><li> Pour certaines B. souches subtilis (en particulier, les souches qui poussent mal en raison de l'intégration de la fusion traductionnelle entre le gène d'intérêt et de la GFP à son locus endogène), la croissance initiale de deux jours avant l'imagerie est nécessaire pour des images de haute qualité. Le premier jour, série B. subtilis souche à imager sur gélose LB avec antibiotique sélectif (s) et incuber une nuit à 30 ° C. Le deuxième jour, inoculer 100 pl de solution saline à 0,85% avec une seule colonie et de réaliser trois de 10 dilutions successives sur les plaques d'agar LB (avec des antibiotiques sélectifs), le placage 100 ul de chaque dilution, suivie par une nuit d'incubation à 30 ° C. Le troisième jour, sélectionnez la plaque de dilution avec une croissance confluente lumière des cellules. Lumière croissance confluente sur une plaque fournira le milieu de croissance avec une bonne santé, l'inoculum de départ en croissance exponentielle pour éventuellement donner des résultats excellents imagerie (voir étape 4). Cette étape est particulièrement utile pour l'imagerie de membrane de haute qualité avec la tache FM4-64. </li><li> B. Autres souches subtilis peut simplement être appliquée à un milieu LB gélose sélective pour les colonies isolées avec un bâton stériles le jour précédant l'imagerie et incuber une nuit à 30 ° C. Le jour suivant, les cellules sur cette plaque sera suffisant pour utiliser comme inoculum pour l'imagerie (voir étape 4). REMARQUE: Pour B. subtilis, cultures de la nuit dans un milieu liquide ne sont pas appropriées en raison d'une combinaison de la formation de spores et les réponses de quorum, ce qui provoquera une longue période de croissance une phase de latence. </li></ol> 2. Le matin de l'imagerie, placer 10 ml de S7 50 moyennes 1-3 dans un flacon Erlenmeyer de 125 ml stérile. 3. Resuspendre les cellules dans un maximum de 2 mL de S7 50 moyennes de la plaque de gélose LB avec des colonies isolées ou les cellules confluentes de lumière pour obtenir un inoculum. 4. Ajouter suffisamment S7 50 moyen de cellules d'inoculum à l'erlenmeyer contenant 10 ml S7 50 moyennes pour une culture avec une densité optique initiale mesurée à 600 nm (DO 600) de ~ 0,08 à 0,1. À cette étape, il est important d'avoir au moins un air de 10 fois le ratio moyen. Ainsi, nous utilisons 10 à 12,5 ml de milieu inoculé dans un flacon Erlenmeyer de 125 ml. 5. Croître chaque culture à 30 ° C jusqu'à ce que la culture atteint une DO 600 ~ de 0,5 à 0,8. Bains à agitation sont préférés aux révolutions par minute à partir 150-200. Cultures a contesté avec des agents endommageant l'ADN induisant ou de l'asymétrie doit être à une phase de croissance exponentielle au début OD 600 de telle sorte que les cellules vont atteindre l'objectif OD 600 avec la période de croissance supplémentaire qui est requis pour le traitement (voir tableau 1) Par exemple, la 2-aminopurine nécessite une heure de traitement, et donc une culture traitée avec la 2-aminopurine devrait être à une DO 600 ~ 0.3 à 0.4, telles que l'heure l'un des traitements / résultats de croissance dans une DO 600 ~ 0.5-0.8, par lequel les cellules sont prêtes pour l'imagerie. Préparation des échantillons 1. Pipeter 300 ul de cellules cultivées dans un tube de 1,5 ml. 2. Si l'imagerie des membranes cellulaires est souhaitée, ajoutez la dilution de 1:1000 FM4-64 membrane tache (Invitrogen) pour chaque échantillon d'une solution à 1 mg / ml. Un titrage de FM4-64 peut être nécessaire pour atteindre le signal de fluorescence désirée. Une gamme de titrage typique est 1:100, 1:1000 et 1:10000. 3. Laisser les échantillons reposer à température ambiante pendant jusqu'à dix minutes ou alors la lame est en préparation avec 1% d'agarose en 1X moyennes Spizizens comme décrit ci-dessous (voir l'étape 1 de "préparation des lames»). 4. Si la concentration de cellules est nécessaire, nous préférons les cellules de filtrage utilisant un filtre de 0,2 um avec un appareil à vide. Les cellules peuvent ensuite être lavés en douceur de la surface du filtre avec du PBS, un autre tampon approprié ou moyenne avant la visualisation. Préparation des lames 1. Préparer agarose à 1% avec 1X Spizizens. Ajouter 5 ml de bouillon de Spizizens 10X à 45 ml ddH2O avec 0,5 g d'agarose, et micro-ondes pour faire fondre. Chaud agarose fondu est difficile de pipette, et solidifié agarose n'entrera pas dans la pointe de la pipette. L'agarose doit être équilibrée dans un bain d'eau à une température de 55-65 ° C ~ pour elle d'entrer dans la pointe de la pipette sans se solidifier dans le pointe. 2. Tirage 20 ul de Spizizens avec 1% d'agarose fondu dans la pointe de la pipette. Pipeter une seule goutte (environ 1-2 pi) de la solution d'agarose dans chaque diapositive ainsi (nous utilisons 15 et diapositives, voir tableau 2) pour former superficielle coussinets d'agarose. L'agarose se solidifie immédiatement. Les diapositives doivent également être faite immédiatement avant l'application de ces cellules. Si les plaquettes sont agarose laissé à température ambiante seuls, ils peuvent se déshydrater en quelques minutes et devenir inutilisable. Coussinets agarose doit être centré et remplir chaque bien, mais avoir une hauteur minimale pour éviter de perturber la lamelle, si les gouttelettes sont trop élevés (en bulle) ou si l'échantillon se propage au-delà des limites bien, passez simplement le bien nettoyer avec un Kimwipe et appliquer une nouvelle agarose pad. 3. Appliquer l'ensemble échantillon de 300 ul (voir étape 6) à la diapositive, distribué sur le dessus de chaque pad agarose. Cette quantité de cellules devrait être suffisante pour couvrir chaque puits sur la diapositive. 4. Laisser la lame avec des cellules chargées de s'asseoir à la température ambiante (23 ° C) pendant environ dix minutes. Cette étape va permettre aux cellules de s'installer sur le coussin d'agarose devenir immobiles et prêts pour l'imagerie. Pour des besoins spécialisés de cette température peut être nécessaire de changer, par exemple, lors de la réalisation des expériences qui nécessitent un changement de température 4. 5. Aspirer l'écart moyen supérieur de chaque puits sans enlever les plaquettes elles-mêmes. 6. Appliquer la lamelle sur la lame, en appuyant fermement et uniformément, mais doucement, à travers la zone de la diapositive. Assurez-vous que la lamelle est contre la lame et que la lamelle n'est pas élevée au-dessus de la diapositive. Visualisation des cellules 1. Beaucoup de différents microscopes à fluorescence va bien travailler. Il est essentiel d'avoir une lentille d'huile d'immersion 100X. Le laboratoire utilise Simmons: <ul><li> Olympus BX61 microscope équipé d'1,45 NA TIRFM huile lentille 100X objectif à immersion </li><li> Hamamatsu ORCAR 2 CCD refroidi appareil </li><li> Lumen métallique à l'arc 200 (Avant) source de lumière. </li><li> Pour la détection de la GFP (ITCF), filtre d'excitation et d'émission de 460 à 500 510 à 560 </li><li> Pour la détection de FM4-64 (TRITC), filtre d'excitation et d'émission de 510 à 560 572 à 648. </li><li> Les images ont été capturées à l'aide SlideBook 4,2 (figure 1) </li></ul> 2. Apportez les cellules en utilisant concentrer la lumière blanche. 3. Capturer l'image en utilisant des filtres appropriés pour chaque fluorophore. Les résultats représentatifs Des images représentatives sont affichés (figure 1). GFP foyers doivent être bien définis, tandis que FM4-64 coloration doit être claire et lumineuse 4-7. Images GFP ou membrane peut être pseudo-couleur avec n'importe quelle couleur, afin de permettre la meilleure qualité d'image qui sera présentée sans perdre aucune donnée. <img src="/files/ftp_upload/1736/1736fig1.jpg" alt="Figure 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1"> Figure 1: les images représentant la GFP de B. subtilis protéines de fusion traductionnelle. protéines GFP sont indiquées en vert, tandis coloration FM4-64 membrane est représentée en rouge. La barre d'échelle blanche indique 3 microns (A) MutS-GFP [génotype pertinents: mutS - gfp (CPS), Amye:: CCPFP mutL (chat)]. En présence de 600 ug / ml 2-aminopurine et 1 mM d'IPTG. FM4-64 du signal n'est pas présentée de manière à montrer plus clairement les foyers MutS-GFP (B) MutL-GFP [génotype pertinents: mutL:: mutL-GFP (SPC)].. En présence du 2-aminopurine (C) DNAX-GFP [génotype pertinents: DNAX:: DNAX-GFP (SPC)]. (D) RecA-GFP [génotype pertinents: recA:: recA-GFP (SPC)] en présence de 20 ng / ml de mitomycine C (E) tagC-GFP [génotype pertinents: tagC:: tagC-GFP (CPS) ] en présence de 1 pg / ml de mitomycine C. <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td> Traitement / concentration ou la quantité </td><td> Fonction </td><td> Temps d'incubation </td></tr><tr><td> La mitomycine C (MMC) [20 à 150 ng / ml] </td><td> Agent alkylant l'ADN </td><td> 1 heure </td></tr><tr><td> 2-aminopurine (2-AP) [600 ug / ml] </td><td> induisant discordance </td><td> 1 heure </td></tr><tr><td> L'hydroxyurée (HU) </td><td> épuise les dNTP </td><td> 3 heures </td></tr><tr><td> la lumière ultraviolette (UV) 20 J/m2 </td><td> Thymine-thymine dimères et 6-4 photoproduits </td><td> varie selon la source, habituellement 20 secondes </td></tr><tr><td> grays (rayonnements ionisants) 5 à 100 Gy </td><td> Cassures double brin, cassures simple brin et les sites de dégâts de base </td><td> varie selon la source </td></tr></tbody></table>»&gt; Tableau 1. Résumé des endommageant l'ADN et des traitements induisant discordance <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Société </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires (optionnel) </td></tr><tr><td> Multitest diapositives, 15 puits </td><td> MP Biomédical </td><td> 6041505E </td><td></td></tr><tr><td> Verre Couverture Microscope </td><td> Fisher </td><td> 12 à 544-B </td><td></td></tr><tr><td> Agarose </td><td> Fisher </td><td> BP160-500 </td><td></td></tr><tr><td> Mitomycine C </td><td> Sigma </td><td> M0503-2MG </td><td> mutagène, porter des gants </td></tr><tr><td> 2-aminopurine </td><td> Sigma </td><td> A3509-250MG </td><td> des gants </td></tr><tr><td> L'hydroxyurée </td><td> Sigma </td><td> H8627-25G </td><td> des gants </td></tr><tr><td> FM4-64 </td><td> Invitrogen </td><td> T13320 </td><td> sensible à la lumière </td></tr></tbody></table> Tableau 2. Liste des réactifs et équipements spécifiques:

<ol><li>Hardwood, C. R., Cutting, S. M. Molecular Biological Methods for Bacillus. , John Wiley and Sons. Chichester. (1990).</li>
<li>Berkmen, M. B., Grossman, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+and+temporal+organization+of+the+Bacillus+subtilis+replication+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Spatial and temporal organization of the Bacillus subtilis replication cycle.</a> Mol. Microbiol. 62, 57-71 (2006).</li>
<li>Simmons, L. A., Grossman, A. D., Walker, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clp+and+Lon+proteases+occupy+distinct+subcellular+positions+in+Bacillus+subtilis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Clp and Lon proteases occupy distinct subcellular positions in Bacillus subtilis.</a> J. Bacteriol. 190, 6758-6768 (2008).</li>
<li>Simmons, L. A., Grossman, A. D., Walker, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+is+required+for+the+RecA+localization+response+to+DNA+damage+in+Bacillus+subtilis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Replication is required for the RecA localization response to DNA damage in Bacillus subtilis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 104, 1360-1365 (2007).</li>
<li>Simmons, L. A., Davies, B. W., Grossman, A. D., Walker, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((b+Clamp+Directs+Localization+of+Mismatch+Repair+in+Bacillus+subtilis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">b Clamp Directs Localization of Mismatch Repair in Bacillus subtilis.</a> Mol. Cell. 29, 291-301 (2008).</li>
<li>Simmons, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+responses+to+double-strand+breaks+between+Escherichia+coli+and+Bacillus+subtilis+reveals+different+requirements+for+SOS+induction%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Comparison of responses to double-strand breaks between Escherichia coli and Bacillus subtilis reveals different requirements for SOS induction.</a> J. Bacteriol. 191, 1152-1161 (2009).</li>
<li>Smith, B. T., Grossman, A. D., Walker, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+mismatch+repair+in+bacterial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Visualization of mismatch repair in bacterial cells.</a> Mol. Cell. 8, 1197-1206 (2001).</li>
</ol>

Essais et erreurs sont nécessaires pour trouver des conditions d&#39;exposition pour des images de haute qualité pour chaque souche; nous trouvons que 1 milliseconde est approprié pour des images en lumière blanche, tandis que des expositions de 100 à 2000 ms sont appropriés pour la GFP (FITC) et FM4-64 (TRITC ) des images. Le temps d&#39;exposition varie en fonction de l&#39;équipement d&#39;imagerie utilisée. Nous recommandons l&#39;utilisation d&#39;une souche par lame de microscope 15 puits pour les plus simples d&#...

Recettes solution spécifique 1: S7 10x 50 sels de 0,5 M MOPS 100 mM de sulfate d&#39;ammonium 50 mM phosphate de potassium monobasique Stériliser par filtration, et enveloppez-S7 50 médias dans la feuille avant l&#39;entreposage Métaux 100x 0,2 M MgCl 2 70 mM de CaCl2 5 mM de MnCl2 0,1 mM ZnCl2 100 pg / ml de thiamine HCl 2 mM HCl 0,5 mM FeCl 3 * dH 2 O au volume final * FeCl 3 devrait être ajouté en dernier, pour empêcher la précipitation. Après la stérilisation du filtre, la solution de métal envelopper dans du papier 100x. S7 50 médias 1x S7 50 sels de Métal 1x 1% de glucose Glutamate 0,1% 40 ug / ml tryptophane 40 ug / ml phénylalanine H 2 O distillée au volume final Spizizens 10x (grammes / L) 151,4 mM de sulfate d&#39;ammonium (20g / L) 803,8 mM Potassium phosphate monobasique (140g / L) 440,9 mM de potassium phosphate dibasique (60g / L) 34,0 mM citrate de sodium (10g / L) 16,6 mM MgSO 4 (2g / L) dH 2 O au volume final Stériliser par filtration

mismatch repair imagerie et les réponses cellulaires aux dommages de l&#39;adn dans<embacillus subtilis></em

Imaging Mismatch Repair and Cellular Responses to DNA Damage in Bacillus subtilis

Les deux procaryotes et les eucaryotes répondent aux dommages à l&#39;ADN à travers un ensemble complexe de changements physiologiques. Altérations de l&#39;expression génique, la redistribution des protéines existantes, et l&#39;assemblage des complexes protéiques nouvelle peut être stimulée par une variété de lésions de l&#39;ADN et dépareillés paires de bases d&#39;ADN. La microscopie à fluorescence a été utilisé comme un puissant outil expérimental pour la visualisation et la quantification de ces réponses et autres lésions de l&#39;ADN et à surveiller l&#39;état de réplication de l&#39;ADN au sein de l&#39;architecture complexe subcellulaire d&#39;une cellule vivante. Fusions traductionnelles entre les protéines rapporteur fluorescent et des composants de la réplication de l&#39;ADN et les machines de réparation ont été utilisés pour déterminer les indices que les protéines cibles réparation de l&#39;ADN de leurs lésions apparentées<em&gt; In vivo</em&gt; Et de comprendre comment ces protéines sont organisées dans les cellules bactériennes. En outre, les fusions transcriptionnelles et translationnelle liée à des promoteurs inductibles endommager l&#39;ADN ont révélé que les cellules au sein d&#39;une population ont activé les réponses au stress génotoxique. Dans cette revue, nous proposons un protocole détaillé pour l&#39;utilisation de la microscopie par fluorescence à l&#39;image de l&#39;assemblage de réparation de l&#39;ADN et des complexes de réplication de l&#39;ADN dans des cellules bactériennes simples. En particulier, ce travail se concentre sur les protéines de réparation des mésappariements d&#39;imagerie, la recombinaison homologue, la réplication de l&#39;ADN et une protéine de SOS-inductible dans<emBacillus subtilis&gt;</em&gt;. Toutes les procédures décrites ici sont facilement prête pour les complexes protéiques d&#39;imagerie dans une variété d&#39;espèces de bactéries.

Un protocole détaillé est décrit pour l&#39;imagerie en temps réel la formation de complexes de réparation de l&#39;ADN<emBacillus subtilis&gt;</em&gt; Cellules.

Mismatch repair imagerie et les réponses cellulaires aux dommages de l&#39;ADN dans<emBacillus subtilis></em

Les procaryotes et les eucaryotes répondent tous deux aux dommages de l'ADN par un ensemble complexe de changements physiologiques. Des altérations de l'expression génique, la redistribution...

Souches TLU de Baus portant des fusions traductionnelles de réparation des appariements. Les protéines fusionnées à la GFP sont étalées sur un milieu sélectif. Les cellules prélevées sont utilisées comme inoculum frais pour une culture liquide.Les cellules sont cultivées jusqu'à ce que l'OD 600 atteigne une valeur comprise entre 0,3 et 0,4, moment auquel des traitements induisant des mésappariements sont appliqués selon le besoin, et les cellules sont ensuite cultivées davantage jusqu'à atteindre un OD 600 compris entre 0,5 et 0,8, après quoi les cellules sont prélevées. Le colorant membranaire FM 4-64 est ajouté si désiré, puis les cellules sont déposées sur des lames munies de tampons aros préparés et laissées à se déposer après élimination du milieu excédentaire par aspiration.Un coverslip est appliqué et les cellules sont visualisées par microscopie. Bonjour, je suis le Dr Andrew Kow du laboratoire du Dr Lyle Simmons du Département de biologie moléculaire, cellulaire et du développement à l'Université du Michigan à Ann Arbor. Aujourd'hui, nous allons vous montrer une procédure utilisée pour visualiser des fusions traductionnelles des protéines de réparation des mésappariements de l'ADN ainsi que d'autres protéines de réparation et ribosomiques chez Bacillus solus.Nous utilisons cette procédure pour étudier l'interaction entre les protéines de réparation des mésappariements de l'ADN et les protéines ribosomiques dans des cellules vivantes de bacillus subtiles. Commençons donc. Pour commencer cette procédure, préparez les souches de B sublist contenant la protéine de fusion traductionnelle que vous souhaitez visualiser pour certaines souches.Commencer un jour avant l’imagerie est suffisant. Parmi les exemples figurent les souches qui se développent bien lorsque la fusion traductionnelle entre la GFP et le gène d’intérêt est intégrée au locus endogène du gène, comme MU LGFP. Lorsqu’on commence un jour avant l’imagerie, utilisez un bâtonnet stérile, en conditions stériles, pour appliquer les bactéries sur un milieu solide LB sélectif en plaques.Pour obtenir des colonies isolées, effectuez une incubation toute la nuit à 30 degrés Celsius ; le lendemain, les colonies seront utilisées comme inoculum précurseur. Certaines souches de B. subtilis nécessitent deux jours de croissance avant la microscopie afin d'obtenir des images de haute qualité. Les souches spécifiques nécessitant deux jours de croissance sont celles qui se développent mal en raison de la fusion traductionnelle, comme recA-GFP ; le premier jour, étalez les bactéries sur un milieu LB sélectif contenant AED et incubez toute la nuit.Le deuxième jour, effectuez une dilution sérielle. Commencez par prélever une colonie unique afin d'inoculer 100 microlitres de solution saline à 0,85 %, puis réalisez quatre dilutions sérielles d'un facteur dix. Déposez 100 microlitres de chaque dilution saline, ainsi que de la colonie initiale et de la solution saline, sur des géloses LB contenant des antibiotiques sélectifs. Incubez les boîtes pendant la nuit, généralement à 30 degrés Celsius, après la deuxième incubation nocturne. Sélectionnez la boîte de dilution présentant une croissance cellulaire légèrement confluente.Ces cultures fournissent un inoculum de départ sain et en croissance exponentielle, pouvant potentiellement donner d'excellents résultats d'imagerie. Cela est particulièrement utile pour l'imagerie de la plus haute qualité de la coloration membranaire. Avec FM 4 64, le matin de l'imagerie, placer 10 millilitres de milieu S seven 50 dans un flacon stérile de 125 millilitres.Ainsi, maintenir un rapport air sur milieu d'au moins dix fois. Resuspendre les cellules dans jusqu'à deux millilitres de milieu S750 provenant du LPPL avec des colonies isolées ou des cellules en confluence similaire afin d'obtenir un inoculum. Ajouter suffisamment d'inoculum cellulaire en milieu S750 dans le flacon Erlenhmeyer contenant 10 millilitres de milieu S750 pour que la culture ait une DO600 initiale d'environ 0,08 à 0,1.Ensuite, faire croître chaque culture à la température appropriée pour l'acquisition d'images de la souche B. On préfère utiliser des bains d'incubation agités avec une vitesse de rotation comprise entre 150 et 200 tours par minute. Poursuivre la croissance des cultures jusqu'à ce qu'elles atteignent une DO à 600 nm d'environ 0,5 à 0,8.Pour les cultures exposées à des agents induisant des lésions de l'ADN ou des appariements incorrects, planifiez le traitement de sorte que la fin de la période d'incubation avec l'agent modifiant l'ADN coïncide avec le moment où la densité optique cible à 600 nm est atteinte. Par exemple, la deux-amino purine, un analogue de base azotée qui imite une paire de bases mal appariée lorsqu'elle est incorporée dans le génome, nécessite une incubation d'une heure et conduit à la formation de foyers de protéines de réparation des appariements incorrects, telles que MutL-GFP. En revanche, la formation de foyers REC-A-GFP nécessite une incubation d'une heure avec la mitomycine C ou un autre réactif induisant des cassures double brin de l'ADN ; les deux-amino purine et la mitomycine C sont ajoutées simultanément.Lorsque les cultures atteignent une DO à 600 nm d'environ 0,3 à 0,4 et après l'heure de croissance requise avec le traitement approprié, elles auront très probablement atteint une DO à 600 nm de 0,5 à 0,8 et seront prêtes à être observées en microscopie. Commencez par prélever 300 microlitres de cellules cultivées à l’aide d’une pipette et transférez-les dans un tube microcentrifuge de 1,5 millilitre. Si l’on souhaite visualiser les membranes cellulaires avec une dilution au 1/1000 d’un colorant membranaire FM 4 64 à 1 milligramme par millilitre pour chaque échantillon, une titration du FM 4 64 peut être nécessaire afin d’obtenir le signal de fluorescence souhaité.Une plage de titrage typique est comprise entre un et 100, un et 1001 à 10 000. Laisser les échantillons reposer jusqu'à 10 minutes ou pendant la préparation de la lame. Si la concentration des cellules est requise, filtrer les cellules à l'aide d'un filtre de 0,2 micromètre avec un appareil sous vide.Ensuite, lavez délicatement les cellules du filtre avec un tampon ou un milieu approprié pendant que les échantillons cellulaires incubent avec FM 4-64. Préparez de l'agarose à 1 % avec un tampon x zens en ajoutant cinq millilitres de solution mère de 10 x zens à 45 millilitres d'eau distillée, ainsi que 0,5 gramme d'agarose, puis chauffez au micro-ondes pour faire fondre.Laisser équilibrer la température des aros dans un bain-marie à environ 65 degrés Celsius et prélever 20 microlitres d'espèce. Terminer par 1 % d'aros fondu dans une pointe de pipette. Des aros trop chauds sont difficiles à pipeter, tandis que des aros froids vont se solidifier et ne pas pénétrer dans la pointe de pipette.Ensuite, utilisez une lame multicavités de 15 puits et pipetez une goutte unique d'environ un à deux microlitres de la solution d'aros dans chaque puits de la lame pour former des plots peu profonds d'aros, qui se solidifieront immédiatement.Les lames sont préparées immédiatement avant l'application des cellules afin d'éviter la déshydratation, qui rendrait les lames inutilisables. Les pastilles aros doivent être centrées et remplir chaque puits, mais présenter une hauteur minimale afin de ne pas perturber le coverslip. Si les gouttes sont trop hautes, présentent des bulles ou si l'échantillon s'étend au-delà des limites du puits, il suffit de nettoyer le puits avec un essuie-tout kim et d'appliquer une nouvelle pastille aros.Maintenant que la lame est prête, appliquez l'échantillon complet de 300 microlitres précédemment mis de côté dans le tube de microcentrifugeuse sur la lame, en répartissant l'échantillon sur la partie supérieure de chaque pastille aérosol. Cette quantité de cellules devrait suffire à couvrir chaque puits de la lame. Laissez la lame chargée de cellules reposer à température ambiante pendant environ 10 minutes.Cette étape permettra aux cellules de se déposer sur le tampon d'agarose et de devenir immobiles, et donc prêtes à être observées en microscopie à la fin de l'incubation de 10 minutes. Aspirez le milieu excédentaire de chaque puits sans retirer les tampons eux-mêmes. Appliquez la lame couvre-objet sur la lame porte-objet en appuyant fermement et uniformément, mais délicatement, sur toute la surface de la lame ; vérifiez que la lame couvre-objet est bien en contact avec la lame porte-objet et qu'elle n'est pas surélevée par rapport à celle-ci.Passez à l'imagerie : de nombreux microscopes à fluorescence différents conviendront. Il est essentiel de disposer d'un objectif à immersion huile de 100 x. Le laboratoire Simmons utilise un microscope Olympus BX 61 équipé d'un objectif à immersion huile de 100 x avec une ouverture numérique de 1,45, adapté à la microscopie par fluorescence en réflexion totale interne ou en turf m.Le microscope est également équipé d'une caméra CCD refroidie et d'une source lumineuse métallique LU 200 arch. Commencez par mettre les cellules au point à l'aide de la lumière blanche. Utilisez le filtre approprié pour chaque flore.Quatre pour la détection de la GFP. Utilisez un filtre d'excitation de 460 à 500 et une émission de 510 à 560 pour la détection du FM 4-64. Utilisez un filtre d'excitation de 510 à 560 et une émission de 572 à 648.Capturez l'image en utilisant les filtres appropriés pour chaque plan. Quatre avec le logiciel Slide Book 4.2. Voici quelques résultats représentatifs de l'imagerie de la protéine de réparation des mésappariements de l'ADN MU L, qui a été fusionnée de façon translationnelle à la GFP.La culture témoin non traitée de MU LGFP présente des foyers minimes, la plupart des cellules ne contenant que des niveaux cytoplasmiques de la protéine de fusion mut LGFP. En revanche, la majorité des cellules cultivées en présence de deux purines aminées, qui imite une base appariée de manière incorrecte lorsqu'elle est intégrée dans le génome, présente des foyers GFP, indiquant que la protéine mutante GFP est impliquée dans la reconnaissance et la réparation des bases d'ADN appariées de manière incorrecte.Des résultats similaires sont obtenus avec la souche REC A GFP cultivée en présence du médicament inducteur de dommages à l'ADN, la mitomycine C. Ici, la majorité des cellules contiennent un foyer de rec A GFP après traitement à la mitomycine C, indiquant que rec A GFP a répondu aux dommages de l'ADN en initiant le processus de réparation, contrairement à ce qui est observé sans traitement à la mitomycine C ni à l'irradiation UV. Nous venons de vous montrer comment visualiser les protéines de réparation dans des cellules vivantes de facius subtlest. Lorsque vous effectuez cette procédure.Il est important de se rappeler de prendre son temps et de mettre correctement les cellules au point, ce qui peut nécessiter un peu d'entraînement. Voilà tout. Merci d'avoir regardé et bonne chance dans vos expériences.

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Nous présentons une procédure par laquelle deux dimensions agarose gel d'analyse peuvent être utilisés pour identifier la structure des intermédiaires de réplication qui se produisent après irradiation UV.

Visualisation des intermédiaires de réplication induite par les UV dans les E. coli En utilisant deux dimensions agarose gel Analyse

L’imagerie spectroscopique électronique permet d’imager et de distinguer l’acide nucléique de la protéine à une résolution nanométrique. Il peut être combiné avec le système miniSOG, qui est capable de marquer spécifiquement les protéines marquées dans des échantillons de microscopie électronique à transmission. Nous illustrons l’utilisation de ces technologies en utilisant des foyers de réparation de cassures double brin à titre d’exemple.

Visualisation des miniSOG protéines marquées de réparation d&#39;ADN en combinaison avec Electron imagerie spectroscopique (ESI)

Ce protocole vise à décrire l’utilisation de laser microirradiation d’induire différents types de lésions de l’ADN, y compris relativement simples brins et lésions complexes, afin d’étudier l’ADN des dommages de signalisation et de réparation facteur Assemblée à sites de dommages in vivo .

Laser Microirradiation à l’étude In Vivo des réponses cellulaires aux dommages d’ADN simples et complexes

Confocal fluorescence microscopie et laser micro-irradiation offre des outils pour induisant des dommages à l’ADN et le suivi de la réponse des protéines de réparation d’ADN dans certaines zones Sub nucléaires. Cette technique a grandement avancer nos connaissances sur la détection des dommages causés, de signalisation et de recrutement. Ce manuscrit montre ces technologies afin d’examiner la réparation de rupture de brins simples et doubles.

Application de Micro-irradiation Laser pour examen du Single et Double brin pause réparation dans les cellules de mammifères

Réparation des cassures double brin de l’ADN est un processus dynamique, qui exige non seulement la formation de complexes de réparation sur les sauts, mais également leur résolution après que la lésion est adressée. Ici, nous utilisons la microscopie d’immunofluorescence pour les pauses bicaténaire transitoires et de longue durée comme outil de disséquer ce mécanisme de maintenance du génome.

Caractériser les processus de réparation de l’ADN à des cassures de l’ADN bicaténaires durables et transitoires de la microscopie par Immunofluorescence

La réponse aux dommages causés par l’ADN par rayonnement activé par le faisceau mixte de neutrons utilisé dans la thérapie de capture de neutrons de bore (BNCT) n’a pas été entièrement établie. Ce protocole fournit une procédure étape par étape pour détecter les foyers induits par rayonnement (RIF) des protéines de réparation par la coloration d’immunofluorescence dans les lignées cellulaires du cancer du côlon humain après irradiation avec le faisceau mélangé à neutrons.

Imagerie d’immunofluorescence des dommages d’ADN et des foyers de réparation dans les cellules cancéreuses du côlon humain

Suite à des dommages à l’ADN, les cellules humaines activent des voies de réparation essentielles pour restaurer l’intégrité de leur génome. Ici, nous décrivons la méthode de l’immunofluorescence indirecte comme un moyen de détecter les protéines de réparation de l’ADN, d’analyser leur recrutement spatial et temporel, et d’aider à interroger l’interaction protéine-protéine sur les sites de dommages à l’ADN.

Visualisation de l’ADN Réparation des protéines Interaction par immunofluorescence

Cet article présente les étapes essentielles de immunoprecipitation d’immunostaining et de chromatine. Ces protocoles sont couramment utilisés pour étudier les processus cellulaires liés aux dommages à l’ADN et pour visualiser et quantifier le recrutement des protéines impliquées dans la réparation de l’ADN.

Visualisation et quantification des dommages à l’ADN spécifiques au site à base d’endonucléase

Ce protocole décrit une méthode pour visualiser un ADN de protéine cassures double-brin de signalisation activées en réponse aux dommages de l'ADN ainsi que sa localisation au cours de la mitose.

Deux et trois dimensions imagerie de cellules vivantes de protéines endommagent l&#39;ADN de réponse

Balises bimoléculaires Ratiométrique (de RBMBs) peuvent être utilisés pour une seule image transcrits d'ARN modifiées dans les cellules vivantes. Ici, nous décrivons la préparation et la purification de RBMBs, livraison de RBMBs dans les cellules par microporation et l'imagerie de fluorescence de transcrits d'ARN simples en temps réel.

Imagerie en temps réel de l&#39;unité d&#39;ingénierie des ARN transcrits dans des cellules vivantes utilisant Ratiométrique bimoléculaires Beacons

Découvrez l'imagerie en temps réel des complexes de réparation de l'ADN dans Bacillus subtilis en utilisant des fusions protéiques GFP. Cette méthode permet d'observer les dynamiques de la réparation des mésappariements dans les cellules vivantes.

Mismatch repair imagerie et les réponses cellulaires aux dommages de l'ADN dans

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