Une méthode améliorée d'isolement d'ARN à partir de pin taeda ( P. taeda L.) et d'autres conifères
22 février 2010
Beaucoup de tissus végétaux, y compris le phloème et le xylème de pin à encens ( Pinus taeda L.), contiennent des niveaux élevés de composés phénoliques et des polysaccharides qui interfèrent avec la purification d'ARN. Cette présentation aborde les techniques pour la récolte du champ cultivé des tissus et l'isolement de l'ARN d'une qualité suffisante pour les microarrays et les analyses génomiques d'autres.
Le texte suivant a été produit par des chercheurs de l'Université de Géorgie et de l'École de foresterie et de ressources naturelles Warnell. Cette vidéo de démonstration décrit la récolte des tissus xylématiques et phloémiens, suivie de l'isolement de l'ARN à partir de Pinus Teta, communément appelé pin à gros cônes, qui est l'espèce de conifère la plus importante pour la production de produits forestiers aux États-Unis. Une fois l'arbre abattu, dans ce cas un arbre âgé de 40 ans, la tige principale est découpée en bûches d'environ 50 centimètres de longueur.
Le tronc est ensuite entaillé longitudinalement à plusieurs endroits à l’aide de la tronçonneuse afin de faciliter le retrait de l’écorce. À l’aide d’un marteau et d’un ciseau à bois, on soulève l’écorce jusqu’à ce qu’elle puisse être détachée par sections. Ensuite, le tissu conducteur est retiré manuellement, prélevé de l’intérieur des morceaux d’écorce, puis immergé immédiatement dans de l’azote liquide.
Une fois l'écorce retirée, la fine couche de xylème secondaire peut être collectée en raclant la surface du tronçon avec une lame de rasoir à face unique. Le tissu xylématique aqueux est immédiatement placé dans de l'azote liquide. Lors de cette récolte, nous avons également prélevé des échantillons de bois de réaction, couramment appelés bois de compression et bois opposé, avant de couper les branches du tronc principal.
L'orientation du rameau est d'abord marquée à l'aide de peinture en aérosol afin de déterminer les zones contenant les deux types de tissus : le bois opposé en partie supérieure du rameau et le bois de compression en partie inférieure. Lors du retrait de l'écorce, les rameaux sont d'abord entaillés à la tronçonneuse le long de lignes délimitant le bois de compression et le bois opposé, et le retrait de l'écorce est effectué comme pour les bûches provenant du tronc principal, à ceci près que seule l'écorce située dans la région correspondant au type de réaction est retirée.
Le bois récolté est retiré à tout moment. Il est généralement plus difficile d'enlever de grandes sections d'écorce de ces petites branches. Les échantillons de bois de réaction du xylème secondaire sont prélevés de la même manière que le xylème secondaire normal, en raclant avec la lame de rasoir et en immergeant immédiatement dans l'azote liquide.
Remarquez la couleur brun rougeâtre caractéristique du bois de compression. Il est important de noter que la collecte et le traitement de plusieurs échantillons provenant d'un arbre de grande taille nécessitent plusieurs personnes, chaque individu effectuant une tâche désignée, afin que tous les types de tissus soient collectés simultanément, ce qui permet de réduire la dégradation de l'ARN. Les échantillons congelés et l'azote liquide sont ensuite transférés dans des sacs de stockage étiquetés et placés sur de la glace sèche pour être transportés au laboratoire. Notre première étape consiste à pulvériser le tissu à l'aide d'un broyeur cryogénique modèle 6850 de Specs. Par rapport au broyage avec un mortier et un pilon, cette étape augmente considérablement les rendements d'extraction d'ARN pour les échantillons de tissus ligneux, tout en maintenant les échantillons au froid à l'aide d'azote liquide.
Le tissu est d'abord broyé manuellement en morceaux plus petits et placé dans la chambre d'échantillonnage. La chambre est insérée dans le porte-échantillon et verrouillée en place, puis l'échantillon est broyé pendant deux minutes. Le produit final a la consistance d'une poudre grossière.
Le protocole d'extraction de l'ARN est un processus s'étalant sur deux jours. Le premier jour, 2,5 grammes de tissu congelé sont ajoutés à un tampon d'extraction d'ARN préchauffé à 65 degrés Celsius. L'échantillon est agité vigoureusement pour homogénéiser, puis un volume égal de chloroforme est ajouté et l'échantillon est à nouveau mélangé par retournement doux.
L'échantillon est ensuite placé sur une roue rotative pendant cinq minutes. L'échantillon est ensuite transféré dans des tubes Oakridge en téflon et centrifugé dans un rotor SS 34 à 12 000 tr/min pendant cinq minutes. La fraction aqueuse supérieure est extraite dans un tube propre et un demi-volume de chloroforme est ajouté.
L'échantillon est vortexé pendant une minute, puis replacé sur la roue tournante pendant cinq minutes. Après une seconde centrifugation, la fraction aqueuse est de nouveau extraite dans un tube en polypropylène haute vitesse de 50 ml et centrifugée à 10 000 tr/min pendant 20 minutes. Pour éliminer tout résidu de particules, l'échantillon est décanté dans un tube Falcon de 50 ml et un quart de volume de chlorure de lithium 10 molaire est ajouté à l'échantillon.
L'échantillon est mélangé par agitation et placé à quatre degrés Celsius pendant la nuit. Le deuxième jour, l'échantillon précipité au chlorure de lithium est d'abord centrifugé à 11 000 tr/min pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius.
Le surnageant est versé et mis au rebut, puis les tubes sont retournés sur des lingettes chimiques pendant une minute. Pour éliminer tout excès de liquide, le culot d'ARN, qui doit être visible, est resuspendu dans 800 microlitres de tampon SSTE chaud préalablement chauffé à 65 degrés Celsius. Veillez à pipeter plusieurs fois vers le haut et vers le bas, ainsi que tout autour des bords du culot, afin de s'assurer qu'il passe entièrement en solution.
Ensuite, transférez l'ARN en suspension dans un tube microfuge sans RNase de deux mil et plus. Incubez l'échantillon pendant un à deux minutes dans un bain-marie à 65 degrés Celsius, puis vortexez pour vous assurer que l'échantillon est complètement resuspendu. Cette étape peut être répétée si nécessaire.
Maintenant, ajoutez un volume égal de phénol tamponné au chloroforme. Vortexez l'échantillon pendant 15 à 20 secondes et centrifugez à 14 000 tr/min pendant trois minutes. La fraction aqueuse est transférée dans un nouveau tube microfuge et un volume égal d'isopropanol est ajouté.
L'échantillon est vortexé et microfusionné comme lors de l'extraction précédente. Pour la phase finale d'extraction organique, les tubes Lock Gel sont d'abord microfusionnés à 11 000 tr/min pendant deux minutes.
Ensuite, l'échantillon d'ARN provenant de l'extraction précédente est ajouté au gel de verrouillage de phase, suivi d'un demi-volume de chloroforme, et les deux sont mélangés délicatement par pipetage. L'échantillon est ensuite centrifugé à 11 000 tr/min pendant cinq minutes, puis l'échantillon aqueux d'ARN est transféré dans un nouveau tube microcentrifuge Ambion sans ARNase. L'étape suivante consiste en une simple précipitation de l'ARN en ajoutant un dixième de volume d'acétate de sodium 3 M, pH 4,8, et deux volumes d'éthanol à 100 %.
L'échantillon est vortexé, placé brièvement dans un congélateur à moins 80 degrés Celsius pendant 30 minutes, puis centrifugé 30 minutes à quatre degrés Celsius. Le surnageant est soigneusement aspiré et le petit culot blanc est lavé avec un millilitre d'éthanol glacé à 70 %, aspiré, puis le lavage à l'éthanol est répété après la dernière aspiration. L'éthanol résiduel est laissé à évaporer en laissant les tubes ouverts sur la paillasse pendant cinq minutes.
Les culots d'ARN sont resuspendus dans 100 microlitres d'eau DEPC et homogénéisés par vortexage et chauffage à 65 degrés. Cette étape peut être répétée si nécessaire. La concentration de l'échantillon est déterminée.
Les rapports spectro-photométriques 260/280 et 260/230 sont calculés afin d'estimer le degré de contamination par des protéines et des glucides dans l'échantillon. Une électrophorèse sur gel d'agarose à 1 % est utilisée pour évaluer qualitativement la qualité de l'échantillon, la contamination par de l'ADN génomique et la dégradation de l'ARN. L'intégrité des échantillons critiques est évaluée plus en détail à l'aide d'un bioanalyseur Agilent 2100 afin de déterminer les rapports ribosomiques 28S/18S et d'obtenir un nombre d'intégrité de l'ARN. Merci d'avoir regardé notre vidéo sur la récolte d'échantillons de tissus et l'isolement d'ARN total à partir de pin maritime (LOB lolly pine).
Les personnes suivantes sont responsables du tournage et de la production de cette vidéo de formation.
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Aperçu
Cette présentation traite de la récolte des tissus xylématiques et phloémiens du pin à encens (Pinus taeda) et de l'isolement subséquent d'ARN. Les techniques visent à surmonter les difficultés posées par les taux élevés de composés phénoliques et de polysaccharides qui interfèrent avec la purification de l'ARN.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Biologie végétale
- Purification de l'ARN
- Analyse génomique
Contexte
- Le pin taeda est une espèce clé pour les produits forestiers aux États-Unis.
- La forte teneur en phénoliques et en polysaccharides complique l'extraction d'ARN.
- Les tissus provenant de plants cultivés en plein champ exigent des techniques de prélèvement spécifiques.
- La qualité de l'ARN est cruciale pour les études par puces à ADN et les recherches génomiques.
Objectif de l'étude
- Démontrer des techniques efficaces de récolte du pin maritime.
- Isoler des ARN de qualité suffisante pour des analyses génomiques.
- Fournir un guide pratique aux chercheurs en biologie végétale.
Méthodes utilisées
- Couper la tige principale d'un pin à encens de 40 ans en bûches.
- Entailler les bûches avec une tronçonneuse pour faciliter l'écorçage.
- Utiliser un marteau et un ciseau à bois pour soulever et détacher l'écorce.
- Retirer manuellement le tissu de phloème et l'immerger dans de l'azote liquide.
Résultats principaux
- Isolation réussie d'ARN à partir de tissus récoltés.
- Démonstration de techniques efficaces pour surmonter les difficultés de purification.
- Mise à disposition d'un guide visuel à l'intention des chercheurs.
- Mise en évidence de l'importance de la qualité de l'ARN pour les applications en aval.
Conclusions
- Les techniques de récolte sont essentielles pour obtenir des ARN de haute qualité.
- Les méthodes sur le terrain peuvent être adaptées à divers tissus végétaux.
- Une isolation efficace des ARN est cruciale pour la recherche génomique.
Questions fréquemment posées
Pertinence industrielle pour les cadres
L'isolement d'ARN de haute qualité à partir de tissus de conifères, tels que le pin taeda, est essentiel pour permettre des analyses génomiques et transcriptomiques fiables dans le développement de biotechnologies végétales. Surmonter les défis posés par les contaminants phénoliques et polysaccharidiques a un impact direct sur la fiabilité prédictive des tests moléculaires en aval et soutient une validation robuste des cibles dans les chaînes de biotechnologie forestière et agricole. Ce protocole amélioré renforce la reproductibilité et l'extensibilité des flux de travail de découverte basés sur l'ARN pour les systèmes végétaux complexes.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmacie
Début de la découverte et validation de la cible
- Permet une analyse rigoureuse de l'expression génique chez les espèces de conifères afin d'élucider les voies métaboliques.
- Facilite la validation fonctionnelle des cibles en fournissant un ARN de haute intégrité pour les essais moléculaires.
- Réduit l'ambiguïté biologique dans les études transcriptomiques des tissus ligneux.
Développement de criblages et de tests
- Facilite la préparation d'échantillons d'ARN validés pour le développement d'analyses par puces à ADN et par RT-qPCR.
- Améliore la reproductibilité des analyses en minimisant les interférences dues aux contaminants dans les réactions enzymatiques.
- Permet un criblage fiable des variations d'expression génique dans divers types de tissus.
Recherche translationnelle et préclinique
- Facilite la découverte de biomarqueurs translationnels en assurant la qualité de l'ARN pour les analyses interspécifiques.
- Assure la continuité entre la collecte des échantillons sur le terrain et la validation moléculaire en laboratoire.
- Réduit les risques dans les études précliniques en standardisant la qualité de l'ARN en entrée pour les applications en aval.
Intégration des pipelines et des flux de travail
Ce protocole d'isolement d'ARN s'intègre à l'interface entre la collecte d'échantillons sur le terrain et le développement de tests moléculaires, reliant la découverte précoce à des analyses génomiques en aval.
- Biologie de la découverte : Permet la vérification d'hypothèses et l'élucidation de voies métaboliques grâce à une extraction d'ARN de haute qualité à partir de tissus végétaux difficiles.
- Écrantage : Fournit de l'ARN prêt à l'emploi pour les tests, avec un minimum de contaminants, assurant un écrantage moléculaire reproductible.
- Analytique : Fournit des métriques quantitatives d'intégrité de l'ARN (par exemple, rapports spectrophotométriques, RIN du bioanalyseur) pour l'évaluation de la qualité des échantillons.
- Recherche translationnelle : S'aligne sur les études de biomarqueurs exigeant une qualité d'ARN constante entre les environnements de terrain et de laboratoire.
- Réutilisation en entreprise : Établit un protocole standardisé et évolutif, adaptable à plusieurs espèces de conifères et de plantes.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance prédictive dans les analyses d'expression génique et transcriptomiques.
- Valeur opérationnelle : Renforce la standardisation, la reproductibilité et le débit de l'isolement d'ARN à partir de tissus complexes.
- Valeur stratégique : Améliore la prise de décision quant à la poursuite ou non de projets, en réduisant le risque d'échec des tests dû à une mauvaise qualité de l'ARN.
- Impact sur le portefeuille : Permet une priorisation ajustée au risque des cibles moléculaires et des gènes candidats dans les filières de biotechnologie végétale.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise dans la collecte de tissus sur le terrain et la manipulation d'échantillons riches en composés phénoliques.
- Suppose l'accès à des équipements spécialisés tels que des broyeurs cryogéniques et des centrifugeuses à grande vitesse.
- Exige une standardisation rigoureuse entre les équipes pour le traitement des échantillons et le contrôle qualité.
- Peut être adapté à diverses espèces de conifères et de plantes ligneuses moyennant des modifications du protocole.
- Les limites potentielles incluent une intensité de main-d'œuvre élevée et la nécessité d'une congélation rapide des échantillons pour éviter la dégradation de l'ARN.
F.A.Q. sur la bio-industrie pharmaceutique
Chapters in this video
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Title
0:23
Tissue Harvest
0:45
Collection of Phloem
1:07
Collection of Secondary Xylem
1:26
Collection of Reaction Wood: Compression and Opposite Secondary Xylem
2:21
Liquid Nitrogen Storage
3:20
RNA Isolation Day 1
2:46
RNA Isolation: Tissue Preparation
4:41
RNA Isolation Day 2
6:35
RNA Precipitation
7:16
Final Resuspension and Quantification
8:02
Credits
