Name: Décrypter Pathways axonale des groupes génétiquement définis de neurones dans le tube neural Chick Utilisant In ovo Lélectroporation (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-05-02T20:17:00.000+00:00
Duration: 7 min 55 s
Description: Découvrez la visualisation des voies axonales de neurones génétiquement définis dans la moelle épinière embryonnaire de poulet par électroporation in ovo. Cette méthode permet d'étudier efficacement les trajectoires axonales.

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Ce travail a été soutenu par des subventions à l&#39;AK de la Fondation d&#39;Israël sciences, le ministère israélien de la santé, et la DFG (Fondation allemande de recherche).

I. L&#39;électroporation La manipulation des œufs <ol><li> Placez les oeufs dans un incubateur humidifié à l&#39;ensemble 37-38 ° C, de préférence un incubateur avec un plateaux à bascule. </li><li> Embryon sont électroporées après environ 66 heures de l&#39;incubation, quand ils ont atteint Hamburger &amp; Hamilton (HH) stade de 18-20. A ce stade, la tête se trouve à angle droit avec le tronc (condition appelée flexion cervicale) et un vaste ensemble de vaisseaux sanguins extra-embryonnaires, comme antérieure, postérieure, droite et gauche veines vitellines doivent être considérés. C&#39;est un stade optimal pour enhancer-dépendante l&#39;expression spécifique 1,3,4. Il est important de surveiller la température et l&#39;humidité de l&#39;incubateur, afin d&#39;obtenir des embryons viables et synchronisés. </li><li> Après 66 heures d&#39;incubation, retirer les oeufs de l&#39;incubateur. Placez les oeufs à l&#39;horizontale. Attendre 5-10 minutes. L&#39;embryon est maintenant située au pôle supérieur de l&#39;œuf. </li></ol> Préparatifs <ol><li> Préparer une solution de Hank avec de la pénicilline / streptomycine (P / S) (dilution 1:100). </li><li> Tirez capillaires en verre (0,5 mm de diamètre) pour microcapillaire. </li><li> Placer les électrodes (tungstène) dans micromanipulateur et connecter les électrodes au générateur d&#39;impulsions (ECM 830). </li><li> Régler le générateur d&#39;impulsions avec les paramètres suivants: 30V tension, le nombre d&#39;impulsions - 3, la longueur de l&#39;impulsion de 50 ms. </li><li> Préparer une pipette bouche, une aiguille de seringue et d&#39;une bande. </li><li> Préparer un mélange souhaité de l&#39;ADN (2-5μg/μl) et ajouter un colorant vert rapide. </li></ol> Fenêtrage et l&#39;électroporation <ol><li> En utilisant une seringue, retirer 5-6 ml d&#39;albumine de chaque œuf. </li><li> Avec un petits ciseaux d&#39;ouvrir une fenêtre ovale à la face supérieure de l&#39;œuf. </li><li> Humide l&#39;embryon avec 0,5-1ml Hank + P / S solution. </li><li> Utiliser une pipette bouche, pour charger le verre avec le mélange de l&#39;ADN microcapillaire. </li><li> Placez l&#39;embryon avec sa queue vers vous. A ce stade, la moelle épinière d&#39;embryon est clairement visible. Par conséquent, aucune des techniques contrastées sont nécessaires. La moelle épinière est scellé aux deux extrémités, la tête et la queue, mais si votre microcapillaire est assez mince, vous serez capable de percer un petit trou et pénètrent dans le tube neural à un angle faible. Un microcapillaire du bon diamètre doit être chargé facilement avec l&#39;ADN, de pénétrer le tube sans l&#39;endommager et libérer l&#39;ADN avec une expiration régulière. </li><li> Injecter de l&#39;ADN à l&#39;aide d&#39;une pipette bouche. Le colorant vert devrait s&#39;étendre de l&#39;extrémité de la queue jusqu&#39;à l&#39;vésicules du cerveau en développement. </li><li> Placer les électrodes en parallèle à la fermeture du tube neural, aussi près que vous pouvez, sans toucher le tube lui-même et le pouls. Au moment de l&#39;impulsion, les électrodes doivent être couverts avec du liquide pour permettre la conductivité électrique. Habituellement, le montant de Hank ajouté à la mendicité est suffisante. Si ce n&#39;est pas ajouter une goutte de Hank, juste avant l&#39;impulsion. </li><li> Retirez délicatement les électrodes et le joint de la fenêtre avec un ruban. Il est important de sceller l&#39;œuf entièrement à prévenir le dessèchement de l&#39;embryon au cours de la période d&#39;incubation suivant. </li><li> Placez le dos d&#39;œufs dans l&#39;incubateur. </li></ol> II. La moelle épinière à livre ouvert la préparation Détachement de la moelle épinière de l&#39;embryon <ol><li> Retirez l&#39;embryon eletroporated, à E6, de l&#39;œuf et le placer dans une boîte de Pétri enduit de silicone contenant du PBS. </li><li> Coupez les membranes et étirer l&#39;embryon sur sa face ventrale utilisant des broches pour le tenir. </li><li> L&#39;utilisation d&#39;un de tungstène forte microcapillaire faire une incision longitudinale le long de la plaque de toit, de la rhombencéphale jusqu&#39;à la queue. </li><li> Faire deux autres incisions longitudinales sur les deux côtés de la moelle épinière, en détachant les ganglions de la racine dorsale (DRG) loin de la moelle épinière. </li><li> Détachez la plaque au sol à partir des tissus à partir de la queue à l&#39;rhombencéphale, laissant intacte la moelle épinière. </li><li> Coupez la moelle épinière dans une section transversale à l&#39;aide de ciseaux fins rhombencéphale et la séparer du corps. </li></ol> Fixation <ol><li> Passez le cordon médullaire isolée dans un nouveau plat de Pétri enduit de silicone contenant du PBS, utilisant des broches pour le tenir, à partir du rhombencéphale à la queue production d&#39;une préparation plate-montage. </li><li> Verser le CPE de l&#39;antenne et le remplacer par du paraformaldéhyde 4% dans un tampon phosphate salin. </li><li> Incuber à température ambiante pendant 1 heure. </li></ol> L&#39;immunohistochimie <ol><li> Transférer la moelle épinière fixée dans un flacon contenant l&#39;anticorps primaire dans le PBS. </li><li> Incuber avec agitations douces pendant la nuit à 4 ° C. </li><li> Laver l&#39;anticorps X5 fois avec du PBS, chaque lavage pendant 1 heure avec agitation douce. </li><li> Ajouter anticorps secondaire et incuber avec les agitations douces pendant la nuit à 4 ° C. </li><li> Laver l&#39;anticorps X5 fois avec du PBS, chaquelaver pendant 1 heure avec agitation douce. </li></ol> Montage livre ouvert pour l&#39;imagerie <ol><li> Étaler la graisse ou de silicone en forme de rectangle sur une diapositive et goutte à goutte de PBS à l&#39;intérieur. </li><li> Placez la moelle épinière étirée au milieu du rectangle à l&#39;aide des pinces et tirer le liquide autour de lui avec une pipette Pasteur. </li><li> Placer 1-2 gouttes de supports de montage sur la moelle épinière et couvrir avec lamelle. Squash c&#39;est pour éviter les bulles d&#39;air. </li><li> Gardez les diapositives dans l&#39;obscurité à 4 ° C. </li><li> Inspectez la moelle épinière en utilisant la microscopie confocale. </li></ol>

<ol><li>Zisman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteolysis+and+membrane+capture+of+F-spondin+generates+combinatorial+guidance+cues+from+a+single+molecule%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Proteolysis and membrane capture of F-spondin generates combinatorial guidance cues from a single molecule.</a> J Cell Biol. 178 (7), 1237-1249 (2007).</li>
<li>Arakawa, T., Iwashita, M., Matsuzaki, F., Suzuki, T., Yamamoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paths%2C+elongation%2C+and+projections+of+ascending+chick+embryonic+spinal+commissural+neurons+after+crossing+the+floor+plate%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Paths, elongation, and projections of ascending chick embryonic spinal commissural neurons after crossing the floor plate.</a> Brain Res. 1223, 25-33 (2008).</li>
<li>Avraham, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+control+of+axonal+guidance+and+sorting+in+dorsal+interneurons+by+the+Lim-HD+proteins+Lhx9+and+Lhx1%5BTitle%5D)+AND+%22+Neural+Dev%22%5BJournal%5D)">Transcriptional control of axonal guidance and sorting in dorsal interneurons by the Lim-HD proteins Lhx9 and Lhx1.</a> Neural Dev. 4 (1), 21(2009).</li>
<li>Timmer, J., Johnson, J., Niswander, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+in+ovo+electroporation+for+the+rapid+analysis+of+neural-specific+murine+enhancers%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">The use of in ovo electroporation for the rapid analysis of neural-specific murine enhancers.</a> Genesis. 29 (3), 123-132 (2001).</li>
<li>Reeber, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manipulating+Robo+expression+in+vivo+perturbs+commissural+axon+pathfinding+in+the+chick+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Manipulating Robo expression in vivo perturbs commissural axon pathfinding in the chick spinal cord.</a> J Neurosci. 28 (35), 8698-8708 (2008).</li>
</ol>

L&#39;électroporation d&#39;ADN plasmidique dans l&#39;embryon de poulet évolue comme une technique puissante pour l&#39;expression ectopique vivo. La combinaison des exhausteurs spécifiques, et l&#39;électroporation chiches fournit un outil rapide et efficace pour déchiffrer les voies axonales d&#39;un groupe de neurones génétiquement défini 1,3,5. Utilisant le système Cre / LoxP et les systèmes d&#39;amplification Gal4/UAS peut augmenter le niveau et la durée d&#39;expression. L&#39;image qui émerge est une...

décrypter pathways axonale des groupes génétiquement définis de neurones dans le tube neural chick utilisant in ovo l&#39;électroporation

Deciphering Axonal Pathways of Genetically Defined Groups of Neurons in the Chick Neural Tube Utilizing in ovo Electroporation

Emploi des éléments activateurs pour conduire l&#39;expression de gènes rapporteurs dans les neurones est un paradigme largement utilisé pour le suivi de la projection axonale. Pour le suivi de projection axonale des interneurones spinaux chez les vertébrés, les gènes de germe de rapporteur en ligne ciblée rendement de marquage bilatéralement symétrique. Par conséquent, il est difficile de distinguer entre les ipsi-et contra-latéral axones saillie. Électroporation unilatérale dans le poussin du tube neural fournit un moyen utile de restreindre l&#39;expression d&#39;un gène rapporteur d&#39;un côté du système nerveux central, et à suivre la projection axonale des deux côtés<sup&gt; 1 ,2-5</sup&gt;. Cette vidéo montre d&#39;abord comment manipuler les oeufs avant l&#39;injection. Au stade de HH 18-20, l&#39;ADN est injecté dans le niveau sacré du tube neural, puis des électrodes de tungstène sont placés parallèlement à l&#39;embryon et de courtes impulsions électriques sont administrés avec un générateur d&#39;impulsions. L&#39;œuf est scellé avec du ruban adhésif et replacée dans un incubateur pour le développement ultérieur. Trois jours plus tard (E6) de la moelle épinière est enlevée comme une préparation à livre ouvert de l&#39;embryon, fixe, et traitées pour la coloration de l&#39;anticorps entier de montage. Le cordon teinté épinière est monté sur glissière et visualisés en utilisant la microscopie confocale.

Cette vidéo montre comment visualiser les voies axonales des groupes génétiquement définis des neurones de la moelle épinière embryonnaire de poulet en utilisant<em&gt; In ovo</emÉlectroporation&gt; de gènes rapporteurs sous le contrôle des éléments activateurs spécifiques.

Décrypter Pathways axonale des groupes génétiquement définis de neurones dans le tube neural Chick Utilisant In ovo L&#39;électroporation

L'utilisation d'éléments amplificateurs pour stimuler l'expression de gènes rapporteurs dans les neurones est un paradigme largement utilisé pour le suivi des projections axonales. Pour le suivi...

Bonjour, je suis Ham du laboratoire du Dr. Review Klar au département de neurobiologie médicale de l'Université hébraïque de Jérusalem. Bonjour, je suis Sophie Esman et je viens également du laboratoire de Lars. Aujourd'hui, nous allons vous montrer une procédure pour l'électroporation in vivo et la préparation en livre ouvert de la moelle épinière.Nous utilisons cette procédure dans notre laboratoire pour étudier les trajectoires axonales de populations neuronales définies génétiquement dans la moelle épinière embryonnaire. Commençons donc. Pour commencer cette procédure, transférez des œufs de poule Leghorn blancs fécondés, conservés à température ambiante, vers un incubateur humidifié, de préférence équipé de plateaux oscillants, à une température de 37 à 38 degrés Celsius.Il est important de surveiller la température et l'humidité de l'incubateur afin d'obtenir des embryons viables et synchronisés. Les embryons de poulet sont électroporés lorsqu'ils ont atteint le stade de Hamburger et Hamilton ou stade HH 18 à 20, qui constitue une étape optimale pour l'expression spécifique dépendante des enhanceurs. À ce stade, la tête est disposée perpendiculairement au tronc.Également au stade HH 18 à 20, un vaste ensemble de vaisseaux sanguins extra-embryonnaires, tels que les vaisseaux des lignes vitellines antérieure, postérieure, droite et gauche, doit également être visible. Les embryons de poulet atteignent le stade HH 19 à 20 après 66 heures d'incubation, et à ce moment, retirez les œufs de l'incubateur. Après avoir retiré les œufs, placez-les horizontalement et attendez cinq à dix minutes. L'embryon se trouve désormais au pôle supérieur de l'œuf.Avant l'électroporation, préparer les embryons dans une solution de Hank contenant 100 unités par millilitre de pénicilline et 0,1 milligramme par millilitre de streptomycine. Préparer un mélange d'ADN à une concentration de deux à cinq microgrammes par microlitre et ajouter quelques cristaux de colorant vert rapide pour faciliter la visualisation de l'ADN injecté. Avoir à portée de main une pipette à bouche, une aiguille stérile pour seringue, de petites ciseaux et un ruban adhésif.Préparez des microcapillaires en tirant des capillaires en verre de 0,5 millimètre de diamètre à l’aide d’un tireur de pipettes. Placez les électrodes en tungstène dans les micromanipulateurs et reliez les électrodes au générateur d’impulsions. Réglez la tension du générateur d’impulsions à moins 30 volts, la durée de chaque impulsion à 50 millisecondes et le nombre d’impulsions à trois.Passez à l'électroporation avant d'exposer et de manipuler les embryons. Insérez une seringue au pôle étroit de l'œuf et retirez cinq à six millilitres d'albumine de chaque œuf. L'albumine est retirée afin d'éviter qu'elle ne se répande.Lors de la coupe à l'étape suivante, utilisez de petites ciseaux pour couper. Ouvrez une fenêtre ovale sur le côté supérieur de l'œuf après avoir mis à nu l'embryon de poulet, puis humidifiez-le avec 0,5 à un millilitre de solution de Hanks contenant de la pénicilline et du streptomycine. Ensuite, utilisez un pipeteur buccal pour charger la microcapillaire en verre.Avec un mélange de colorant d'ADN, une microcapillaire de diamètre approprié doit se charger facilement en ADN. Sous un microscope stéréo, positionnez l'embryon pour injecter l'ADN dans le tube neural. Placez l'embryon avec sa queue tournée vers vous.À ce stade du développement, la moelle épinière est clairement visible et aucune technique de contraste n'est donc nécessaire. La moelle épinière est fermée aux deux extrémités, céphalique et caudale. Toutefois, en effectuant des ponctions avec une microcapillaire pour créer une ouverture supplémentaire dans le tube neural et en pénétrant celui-ci selon un angle peu prononcé, une microcapillaire suffisamment fine et de diamètre approprié devrait traverser le tube sans l'endommager.Injectez l'ADN à l'aide d'un pipeteur buccal. Une microcapillaire de diamètre approprié doit libérer l'ADN lors d'une expiration régulière. Le colorant vert doit s'étendre depuis l'extrémité de la queue jusqu'aux vésicules du cerveau en développement.Injecter jusqu'à ce que le tube neural soit rempli d'ADN. L'électroporation est nécessaire pour que l'ADN injecté pénètre dans les cellules. Premièrement, placer les électrodes parallèlement au tube neural et aussi près que possible de celui-ci sans le toucher directement. S'assurer que les électrodes sont recouvertes de liquide afin d'assurer la conductivité électrique pendant l'impulsion.En général, la solution de Hank ajoutée immédiatement après l'exposition de l'embryon est suffisante. Mais sinon, ajoutez une goutte de solution de Hank juste avant l'impulsion, avec les électrodes positionnées et immergées dans le liquide, puis appliquez l'impulsion électrique. Retirez ensuite soigneusement les électrodes et scellez la fenêtre ainsi que l'œuf avec du ruban adhésif. Il est important de bien sceller l'œuf entièrement afin d'éviter le dessèchement de l'embryon pendant la période d'incubation suivante.Remettez l'œuf dans l'incubateur et poursuivez l'incubation jusqu'à ce que l'embryon de poussin atteigne le stade embryonnaire de développement. Jour six ou E6, moment venu pour l'imagerie, lorsque l'embryon électroporé a atteint le stade embryonnaire de développement. Jour six, E6, trois jours après l'électroporation, retirez-le de l'œuf et placez-le dans une boîte de Pétri revêtue de silicone contenant du PBS à l'aide de ciseaux fins.Retirez les membranes et étirez l'embryon sur son côté ventral à l'aide d'épingles enfoncées dans le silicone pour le maintenir en place. À l’aide d’une microcapillaire en tungstène effilée, pratiquez une incision longitudinale le long de la plaque du toit, depuis le cerveau postérieur jusqu’à la queue.Effectuez deux incisions longitudinales supplémentaires de chaque côté de la moelle épinière, en détachant les ganglions de la racine dorsale ou DRG de la moelle épinière. Détachez la lame du plancher de la moelle à partir de la queue jusqu'au cerveau postérieur, en laissant la moelle épinière intacte. Enfin, utilisez des ciseaux fins pour couper la moelle épinière en section transversale au niveau du cerveau postérieur et séparez-la du corps.À présent que la moelle épinière a été isolée, étalez-la dans une nouvelle boîte de Pétri revêtue de silicone contenant du PBS en utilisant des épingles pour la maintenir depuis le cerveau postérieur jusqu'à la queue, afin d'obtenir une préparation en montage plat. Fixez la moelle épinière dans du paraformaldéhyde 4 % dans du PBS pendant une heure à température ambiante, puis procédez au marquage immunohistochimique selon la procédure d'immunohistochimie décrite dans le protocole écrit accompagnant la mise en place de la moelle épinière ouverte. Préparez-la en forme de livre pour l'imagerie.Étaler de la graisse ou du silicone en forme de rectangle sur une lame et déposer du PBS en gouttes à l'intérieur du rectangle. Utiliser une pince pour placer la moelle épinière, en la tendant au milieu du rectangle, puis absorber le liquide autour. À l’aide d’un applicateur en plastique, déposer une à deux gouttes de milieu de montage sur la moelle épinière et recouvrir d’une lamelle.Appliquez une pression sur la lame couvre-objet afin d'éviter les bulles d'air. Conservez les lames à l'obscurité à quatre degrés Celsius.Examinez la moelle épinière à l'aide d'une microscopie confocale. Voici quelques résultats représentatifs de rejets axonaux d'interneurones spinaux de poulet dans des expériences témoins où la RFP est exprimée dans tous les neurones à l'aide d'un élément amplificateur ubiquitaire du CMV : la majorité des neurones et de leurs axones sont marqués. Il est impossible de déchiffrer la trajectoire axonale des sous-populations neuronales.Cependant, lorsqu'on applique des éléments enhanceurs spécifiques, un trajet axonal défini d'une sous-population spécifique de neurones DI deux est révélé dans cet exemple. Nous venons donc de vous montrer comment électroporer un tube neural de mâchoire avec un enhanceur neuronal spécifique au stade E trois et comment préparer une moelle épinière en livre ouvert au stade E six. Lorsque vous effectuez cette procédure, vous devez vous souvenir de faire preuve de prudence et de patience.Voilà donc tout ce qu'il y a à savoir. Merci d'avoir regardé et bonne chance dans vos expériences. Bonne chance.

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