Décrypter Pathways axonale des groupes génétiquement définis de neurones dans le tube neural Chick Utilisant In ovo L'électroporation

Bonjour, je suis Ham du laboratoire du Dr.Review Klar au département de neurobiologie médicale de l’Université hébraïque de Jérusalem. Bonjour, je m’appelle Sophie Esman et je viens aussi d’un labo Lars. Aujourd’hui, nous allons vous montrer une procédure pour l’Innovo, l’électroporation et la préparation à livre ouvert de la moelle épinière.

Nous utilisons cette procédure dans notre laboratoire pour étudier les trajectoires axonales d’une population neuronale génétiquement définie dans la moelle épinière embryonnaire. Alors commençons. Pour commencer cette procédure, transférez les œufs de poule Leghorn blancs fécondés de la température ambiante dans un incubateur humidifié, de préférence avec des plateaux à bascule à 37 à 38 degrés Celsius.

Il est important de surveiller la température et l’humidité de l’incubateur afin d’obtenir des embryons viables et synchronisés. Les embryons de poussin sont électroporés lorsqu’ils ont atteint les stades 18 à 20 de Hamburger et de Hamilton ou HH, qui est un stade optimal pour l’expression spécifique de la dépendance aux amplificateurs. À ce stade, la tête se trouve perpendiculairement au tronc.

De plus, aux stades 18 à 20 de l’HH, un vaste ensemble de vaisseaux sanguins embryonnaires supplémentaires tels que les vaisseaux de la ligne vitale antérieure, postérieure droite et gauche doit également être observé. Les embryons de poussin atteignent le stade HH 19 à 20 après 66 heures d’incubation, et à ce moment-là, retirez les œufs de l’incubateur Après avoir retiré les œufs, placez-les horizontalement et attendez cinq à 10 minutes. L’embryon est maintenant situé au pôle supérieur de l’œuf.

Avant l’électrothérapie, les embryons préparent la solution de Hank avec 100 unités par millilitre de pénicilline et 0,1 milligramme par millilitre de streptomycine. Préparez un mélange d’ADN souhaité à raison de deux à cinq microgrammes par microlitre et ajoutez quelques grains du colorant vert rapide pour une visualisation facile de l’ADN injecté. Ayez une pipette buccale, une aiguille de seringue stérile, de petits ciseaux et un ruban adhésif à portée de main.

Préparez des microcapillaires en tirant des capillaires en verre de 0,5 millimètre de diamètre à l’aide d’un extracteur de pipette. Placez les électrodes en tungstène dans les micromanipulateurs et connectez les électrodes au générateur d’impulsions. Réglez la tension sur le générateur d’impulsions à moins 30 volts, la durée de chaque impulsion à 50 millisecondes et le nombre d’impulsions à trois.

Procéder à l’électroporation avant d’exposer et de manipuler les embryons. Insérez une seringue au pôle étroit de l’œuf et retirez cinq à six millilitres d’albumine de chaque œuf. L’albumine est retirée pour éviter qu’elle ne se renverse.

Lorsque vous coupez à l’étape suivante, utilisez les petits ciseaux pour couper. Ouvrez une fenêtre ovale sur la face supérieure de l’œuf après avoir révélé l’embryon de poussin, humidifiez-le avec 0,5 à un millilitre d’écheveaux et une solution de pénicilline streptomycine. Ensuite, utilisez un perpet buccal pour charger le microcapillaire en verre.

Avec un mélange de colorants d’ADN, un microcapillaire du bon diamètre devrait se charger facilement d’ADN. Sous une position binoculaire, l’embryon pour injecter l’ADN dans le tube neural. Placez l’embryon avec sa queue vers vous.

À ce stade de développement, la moelle épinière est clairement visible et aucune technique contrastée n’est donc nécessaire. La moelle épinière est scellée à la fois à la tête et à l’extrémité de la queue. Cependant, avec le microcapillaire perce plus de trou dans le tube neural et le pénètre à un angle peu profond, un microcapillaire suffisamment mince et du bon diamètre devrait pénétrer dans le tube sans l’endommager.

Injectez l’ADN à l’aide d’un perpet buccal. Un micro capillaire du bon diamètre devrait libérer l’ADN avec une expiration régulière. Le colorant vert doit s’étendre du bout de la queue jusqu’aux vésicules du cerveau en développement.

Injectez jusqu’à ce que le tube neural soit rempli d’ADN L’électroporation est nécessaire pour que l’ADN injecté pénètre d’abord dans les cellules. Placez les électrodes parallèlement au tube neural et aussi près que possible de celui-ci sans toucher le tube lui-même. Assurez-vous que les électrodes sont recouvertes de liquide pour permettre la conductivité électrique pendant l’impulsion.

Habituellement, la solution de Hank ajoutée immédiatement après l’exposition de l’embryon est suffisante. Mais si ce n’est pas une goutte de la solution de Hank juste avant l’impulsion avec les électrodes positionnées et immergées dans l’impulsion liquide pour électro-opérer, retirez soigneusement les électrodes et scellez la fenêtre et l’œuf avec du ruban adhésif. Il est important de sceller entièrement l’ovule pour éviter le dessèchement de l’embryon pendant la période d’incubation suivante.

Remettez l’œuf dans l’incubateur et incubez jusqu’à ce que l’embryon de poussin atteigne l’embryon de développement. Jour six ou E six, lorsqu’il est temps de passer l’imagerie lorsque l’embryon électroporé a atteint l’embryon de développement. Le sixième jour, E six trois jours après l’électroporation, retirez-le de l’œuf et placez-le dans une boîte de Pétri recouverte de silicone contenant du PBS à l’aide de ciseaux fins.

Coupez les membranes et étirez l’embryon sur sa face ventrale à l’aide d’épingles enfoncées dans le silicone pour le maintenir en place. À l’aide d’un microcapillaire en tungstène tranchant. Faites une incision longitudale le long de la plaque de toit, de la cervelle postérieure jusqu’à la queue.

Faites deux incisions longitudinales supplémentaires des deux côtés de la moelle épinière, en détachant les ganglions de la racine dorsale ou les DRG de la moelle épinière. Détachez la plaque de sol du tissu en commençant par la queue jusqu’au cerveau postérieur, en laissant la moelle épinière intacte. Enfin, utilisez des ciseaux fins pour couper la moelle épinière en une section transversale au niveau du cerveau postérieur et séparer la moelle épinière du corps.

Maintenant que la moelle épinière a été isolée, étalez-la dans une nouvelle boîte de Pétri recouverte de silicone contenant du PBS à l’aide d’épingles pour la maintenir du cerveau postérieur à la queue, produisant ainsi une préparation de montage plat. Fixez la moelle épinière dans du paraldéhyde à 4 % dans du PBS pendant une heure à température ambiante immuno-coloration en suivant la procédure d’immunohistochimie, le protocole écrit détaillé et accompagnant le montage de la moelle épinière ouverte. Préparation du livre pour l’imagerie.

Étalez de la graisse ou du silicone en forme de rectangle sur une lame et versez du PBS à l’intérieur du rectangle. À l’aide d’une pince à épiler, placez la moelle épinière, étirez le milieu du rectangle et aspirez le liquide autour d’elle. Avec des pâtes par animal, placez une à deux gouttes de support de montage sur la moelle épinière et recouvrez d’une lamelle.

Appliquez une pression sur la lamelle. Pour éviter les bulles d’air. Gardez les diapositives dans l’obscurité à quatre degrés Celsius.

Inspectez la moelle épinière à l’aide de la microscopie confocale. Voici quelques résultats représentatifs des rejets axonaux des interneurones de la colonne vertébrale de poulet dans des expériences de contrôle où la RFP est exprimée dans tous les neurones en utilisant un élément amplificateur omniprésent du CMV, la plupart des neurones et leurs axones sont marqués. Il est impossible de déchiffrer le trajet axonal des sous-populations neuronales.

Cependant, lors de l’application d’éléments d’amélioration spécifiques, une voie axonale définie d’une sous-population spécifique DI deux neurones dans cet exemple est révélée. Nous venons donc de vous montrer comment électro-opérer un tube neural de joue avec un amplificateur neuronal spécifique en E trois et comment préparer une moelle épinière à livre ouvert en E six. Lorsque vous effectuez cette procédure, vous devez vous rappeler d’être prudent et patient.

Alors c’est tout. Merci d’avoir regardé et bonne chance dans vos expériences. Bonne chance.