Name: Isolement de cellules humaines endotheliales de veine ombilicale (HUVEC) (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-04-28T00:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 19 s
Description: Apprenez à isoler des cellules endothéliales de veine ombilicale humaine (HUVEC) pour la biologie vasculaire et les assays d'angiogenèse in vitro. Cette technique utilise la collagenase et un milieu enrichi.

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Procédure <ol><li> Lay cordon sur le pavé propre et tamponnez hors excès de sang. Faire des coupes fraîches sur les deux extrémités de la corde. </li><li> Insérez 21 1 / 2 G aiguille avec la gaine en plastique sur l&#39;aiguille, dans la veine. (La veine est la plus grande ouverture, les deux plus petits sont des artères) </li><li> Clamp l&#39;aiguille en place avec une pince hémostatique et de fixer la seringue 20cc de Hanks à l&#39;aiguille. </li><li> Poussez le Hanks dans la veine avec une pression modérée. Collecter les déchets dans le bécher avec l&#39;eau de Javel. (Holding de l&#39;aiguille et le cordon d&#39;une main tout en poussant l&#39;aiguille empêcherait sortent de la veine.) S&#39;il ya beaucoup de sang dans les veines, se laver une seconde fois. </li><li> Lay cordon sur le pad et pince l&#39;autre extrémité de la veine. Remplir avec quelques mL de Hanks pour vérifier les fuites le long de la moelle. Retirer la dose de 5 mL et déconnecter la pince inférieure. </li><li> Déconnecter la seringue 20cc. Retirer le piston de la seringue de 10cc. Attacher une seringue de 10cc à l&#39;aiguille, versez 10 ml de collagénase et de remplacer le piston. Poussez la collagénase dans la veine jusqu&#39;à ce que vous voyez la quantité d&#39;abord sortir l&#39;extrémité ouverte. Re-pince le bout ouvert et de remplir avec de la collagénase jusqu&#39;à il ya une distension modérée de la veine. Distension des résultats Trop de contamination du muscle lisse. </li><li> Massez le cordon doucement. </li><li> Incuber cordon (avec pinces hémostatiques, aiguille et la seringue jointe) dans du DPBS à 37 ° C pendant 15 min. </li><li> Alors que l&#39;incubation, continuent les étapes 1-8 avec 2 ème cordon. </li><li> Après incubation, prenez le cordon hors du bécher et tout en tenant la corde sur le tube de 50 ml couper l&#39;extrémité au-dessus du collier inférieur. Soyez sûr de tout collecter dans le tube. Poussez la collagénase restantes par le cordon, puis fixer la seringue 20cc et pousser Hanks travers avec une pression modérée. </li><li> Si aucune des cellules musculaires lisses sont nécessaires, jeter le cordon pour le moment. Sinon, placez la même corde dans un second tube 50ml avec de la collagénase ~ 5ml et incuber à 37 ° C pendant 30-60 min. </li><li> Garder le tube jusqu&#39;à ce que tous les cordons sont faits. </li><li> Spin tubes à ~ 1200 rpm pendant 5 min. </li><li> Aspirer le surnageant (sauf pour ~ 1-2 ml). Reprendre le culot dans 5mls PHEC + et la plaque dans un T25. </li><li> Incuber à 37 ° C avec 5% de CO 2 pendant la nuit. </li><li> Le lendemain, retirer le surnageant et la remplacer par du milieu frais. S&#39;il ya des globules rouges nombreuses, se laver une fois avec M199, puis ajoutez + PHEC. Poursuivre l&#39;incubation comme d&#39;habitude jusqu&#39;à la plaque est confluente (1-4 jours). Divisé en une T75 gélatinisé. </li><li> Une fois que T75 est confluente, divisé en trois T75s. Gel de deux flacons par flacon. </li></ol> Remarque: les cellules endothéliales (non activé) ont un aspect pavimenteux. Les cellules endothéliales sont parfois activé (long et pointu) juste après l&#39;isolement, après une couple de passes, ils retournent généralement dans un état ​​inactive. Nettoyage <ol><li> Très soigneusement, jeter les aiguilles dans le collecteur de déchets. </li><li> Disposez des seringues dans les containers prévus à grande. </li><li> Mettez tous les tissus dans le sac pour matières contaminées petits. Fermer le sac et congeler à -20 ° jusqu&#39;à ce que l&#39;incinération. </li><li> Faire tremper les instruments dans virucide pour au moins 10 min. </li><li> Ajouter le média d&#39;incubation pour les déchets bécher / eau de javel. Laisser reposer pendant au moins 10 min. </li><li> Jeter les plaquettes banc en déchets biologiques dangereux. </li><li> Vaporiser vers le bas à l&#39;intérieur et l&#39;extérieur de béchers, paillasse et le couvercle bain d&#39;eau avec vircide. Laissez reposer 10 min, puis essuyez. </li><li> Rincez béchers et des instruments à l&#39;eau tiède et accrocher sur une grille pour sécher (blot hors les instruments pour qu&#39;ils ne rouillent pas). </li><li> Eliminer les déchets décontaminés dans l&#39;évier. </li><li> Retour supports inutilisés au réfrigérateur. </li><li> Jeter les gants dans les déchets biologiques dangereux. </li></ol>

<table><tbody><tr><td>Collagénase à 0,1 % </td><td></td><td></td><td>10 mL par cordon, préchauffé à 37 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Flacons de culture tissulaire</td><td></td><td></td><td>T75, un par cordon.</td></tr><tr><td>Milieu de Hanks</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ciseaux</td><td></td><td></td><td>stériles</td></tr><tr><td>bécher</td><td></td><td></td><td>stérile</td></tr><tr><td>tubes de 50 mL</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

isolement de cellules humaines endotheliales de veine ombilicale (huvec)

Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC)

L&#39;angiogenèse est un complexe multi-étapes, où, en réponse à des stimuli angiogéniques, les nouveaux navires sont créés à partir de la vascularisation existante. Ces étapes comprennent: la dégradation de la membrane basale, la prolifération et la migration (germination) des cellules endothéliales (CE) dans la matrice extracellulaire, l&#39;alignement de la CE en cordons, la formation de lumière, anastomose, et la formation d&#39;une nouvelle membrane basale. Beaucoup d&#39;essais in vitro ont été développées pour étudier ce processus, mais la plupart ne reproduisent certaines étapes de l&#39;angiogenèse, et morphologiquement les vaisseaux souvent ne ressemblent pas à des navires in vivo. Ici nous démontrons une optimisation dans le dosage angiogenèse in vitro qui utilise la veine ombilicale humaine CE et les fibroblastes. Ce modèle reprend toutes les étapes clés au début de l&#39;angiogenèse, et surtout les vaisseaux d&#39;affichage lumens brevets intercellulaire entouré par polarisée CE. Les navires peuvent être facilement observées en contraste de phase et de time-lapse microscopie, et récupéré à l&#39;état pur pour des applications en aval.

Ce protocole vidéo illustre l&#39;isolement et la culture de cellules humaines endothéliales de veine ombilicale (HUVEC) de cordon ombilical humain. Une fois isolé ces cellules peuvent être utilisées pour des dosages angiogenèse in vitro comme le dosage optimisé fibrine billes de gel a également démontré par le laboratoire de M. Hughes.

Isolement de cellules humaines endotheliales de veine ombilicale (HUVEC)

L'angiogenèse est un processus complexe comportant plusieurs étapes, au cours desquelles de nouveaux vaisseaux sont créés à partir du réseau vasculaire existant en réponse à des stimuli angiogéniques. Ces étapes...

Bonjour, je m'appelle Jager Davis et aujourd'hui je vais vous montrer comment isoler des cellules endothéliales de la veine ombilicale humaine, également connues sous le nom de ic. Nous utiliserons plusieurs milieux, en commençant par la solution saline équilibrée de Hank, qui servira à nettoyer nos cellules de tout globule rouge ou autre contaminant pouvant être présent dans la veine. Ensuite, nous utiliserons une solution de collagénase remise en suspension dans du DPBS, et cette solution permettra de détacher nos ubic de la veine. Enfin, nous les mettrons en culture dans un milieu 20%effect, composé de M1 99 enrichi en FBS activé par la chaleur et en solution pen stripp.Nous allons également compléter notre suspension de Resus avec un supplément de croissance pour cellules endothéliales fourni par BD Biosciences. Très bien, j'ai une paire de ciseaux anatomiques. Je vais effectuer une incision droite à travers le cordon de cette manière.Ensuite, je vais procéder au nettoyage du cordon. Je vais donc identifier les artères et la veine. Il y a deux artères et une veine.J'identifie généralement les artères par deux. Elles sortent vers vous. Nous en avons donc une ici et une autre artère juste ici.Et comme vous pouvez le constater, la veine pénètre effectivement dans le cordon, et c'est à cet endroit que nous allons placer notre aiguille papillon. Nous utilisons une aiguille papillon Accutane de calibre 21 et de trois quarts de pouce. Ouvrez-la donc.Je vais simplement entrer comme ceci. Encore une fois, je vais identifier les artères. Nous avons une artère et la deuxième artère, puis voici notre veine.Je vais donc prendre l'aiguille papillon et l'insérer très doucement dans la veine, mais vous pourriez rencontrer une certaine résistance. J'aime alors légèrement tourner le cordon tout en poussant l'aiguille simultanément, avec ce type de mouvement, et continuer ainsi jusqu'à ce que les ailettes de l'aiguille papillon soient parfaitement alignées avec le cordon, comme ceci. Nous sommes prêts, vous pouvez maintenant la pincer.Ce que je vais faire maintenant, c'est remplir deux seringues de 20 ml avec 20 ml d'encre. Ensuite, je vais remplir un flacon conique de 50 ml avec 5 ml de 20 % effect. Puis, je vais pipeter 10 ml de DPBS dans l'un de ces flacons coniques de 15 ml.Donc, à ces 15 ml de DPBS, je vais ajouter 10 milligrammes de notre poudre de collagénase, que je vais peser sur une balance. Je vais resuspendre la collagénase en inversant simplement le tube plusieurs fois, jusqu'à ce que la poudre se détache des parois du tube. Environ cinq ou six fois. Par la suite, je vais filtrer stérilement la collagénase en utilisant une seringue de 10 ml pour introduire le filtre.Et maintenant, nous sommes prêts à faire passer ces milieux à travers le cordon. Ce que j'ai fait, c'est verser le DPPS restant dans ce bécher d'un litre, et je vais le placer dans le bain-marie à 37 degrés pour le réchauffer. Ce milieu servira à incuber notre cordon pendant environ 15 minutes.Il s'agit de notre solution de collagénase filtrée. Je vais placer ce tube conique dans le bain d'eau à 37 degrés pour le réchauffer, et je l'utiliserai ultérieurement au cours de la procédure afin de détacher l'uvée de l'intérieur de notre veine. Ensuite, je vais donc pincer le cordon au niveau de l'aiguille papillon, puis faire circuler 20 ml de Hanks à travers le cordon afin d'éliminer les cellules sanguines résiduelles.Après avoir fixé l'aiguille papillon, je vais injecter lentement 20 ml de notre solution de Hanks. Je vais procéder très lentement afin d'éviter toute rupture de la veine. Voilà la vitesse à laquelle vous souhaitez que l'écoulement se fasse, mais vous ne devez pas laisser couler la solution de Hanks en continu.Cela signifie que vous appuyez trop fort. Je le fais donc généralement, vous savez, goutte à goutte. Et encore une fois, je fais passer les mèches à travers afin de nettoyer la veine.Et vous exposez nos cellules terminales. Ensuite, après avoir fait passer toutes nos suspensions, je vais procéder à la pose du cordon, puis je vais pincer l'extrémité inférieure du cordon, retirer la seringue et la placer dans un sac pour déchets biologiques.Ensuite, je vais fixer une nouvelle seringue de 10 ml. Bon, maintenant je vais faire passer la collagénase à travers le cordon, afin de rincer tout résidu éventuellement resté dans notre veine. Et je ferai passer la collagénase en quantité suffisante.Ainsi, lorsqu'il sort par l'extrémité située ici, nous le verrons d'une couleur à peu près identique à celle présente dans la seringue. Ensuite, je vais pincer l'extrémité inférieure du cordon. Ce que je vais faire ensuite, c'est injecter un peu plus de collagénase, juste assez pour voir le cordon se dilater.Après qu’il se soit un peu étendu, je vais procéder au massage du cordon, en partant de la gauche vers la droite. J’utilise généralement trois doigts en exerçant une pression modérément ferme. C’est un peu comme lorsqu’on roule une pâte à fil.Vous ne devez pas appuyer trop fort ni trop doucement sur le cordon. Si vous appuyez trop fort, vous risquez une contamination par des cellules musculaires lisses. Mais si vous procédez trop délicatement, vous ne parviendrez pas à détacher les Q en arrière.Donc, environ cinq à six secondes à un endroit donné, puis progresser progressivement vers le bas. Je vais donc transférer le cordon de la table dans le bain-marie à 37 degrés et le laisser reposer pendant 15 minutes en incubation. Ainsi, un prélèvement peut nécessiter une incubation de 15 minutes.Un autre lot peut être de 20 minutes, et un troisième lot pourrait être de 10 minutes. Il est donc important d'optimiser le temps d'incubation pour notre lot particulier. Ici, il est de 15 minutes.Nous allons retirer nos cordons du bain DPVS. Nous allons le poser ici pendant une seconde. Nous retirons le bouchon de notre tube conique de 15 ml contenant nos 5 ml de feck à 20 %.Le 20 % feck contient un inhibiteur de la trypsine, ce qui va arrêter l'action de notre collagénase. Je vais donc maintenir le cordon au-dessus du tube avec nos ciseaux. Et ce que je vais faire maintenant, c'est couper le long de la ligne de notre pince. Vous déplacez la section inférieure ici. Très bien, nous avons maintenant une coupe fraîche à l'extrémité de notre cordon. Et ce que je vais faire ensuite, c'est introduire notre collagénase.Et encore une fois, tout comme avec les hanks, vous ne voulez pas pousser trop vite. Voilà la vitesse à laquelle vous devez faire passer votre solution tampon. Et ce sera tout pour notre collagénase.Parfois, vous constaterez que la seringue est fixée un peu trop serrée. Dans ces cas-là, j'utilise la pince que nous avions sur notre cordon ombilical et je la saisis simplement ici, puis je la visse doucement, juste assez pour desserrer, ce qui me permet de l'enlever à la main ou qu'elle se détache d'elle-même. Ensuite, je prendrai notre seringue restante de 20 ml de hangs et je l'attacherai à notre aiguille, puis je ferai passer tout le volume de hangs.Encore une fois, je vais pousser très lentement, tout comme avec la collagénase et l'autre seringue de Hank, voilà, goutte à goutte. C'est à peu près la vitesse à laquelle vous devez injecter votre milieu. Celui-ci contient 20 % de Hank et notre solution de collagénase.Je vais maintenant le placer dans une centrifugeuse et centrifuger pendant cinq minutes à 1200 tr/min. Je vais donc vérifier que le couvercle est bien fermé. Nos deux, et je vais le placer dans notre centrifugeuse.Nous avons effectué une centrifugation de cinq minutes à 1200 tr/min. Nous avons donc centrifugé notre tube conique de 50 ml pendant cinq minutes à 1200 tr/min. Ce qui nous reste est un petit culot au fond du tube. Ce culot est composé de quelques globules rouges résiduels et de nos cellules endothéliales.Ce que je vais faire ensuite consiste à aspirer le Bernet et le reus, à resuspendre notre culot dans cinq millilitres de PBS à 20 %, puis à pipeter doucement plusieurs fois de haut en bas jusqu'à ce qu'il semble qu'il y ait peu de débris dans la suspension. Je vais pipeter les cinq millilitres entiers et les ensemencer sur un flacon T25. J'essaierai d'être prudent pour ne pas générer de bulles.Et je vais ajouter mon ECPS. J'ajouterai 50 microlitres, et je vais simplement incliner doucement le flacon afin de m'assurer que tout l'ECPS se répartit dans le flacon. C'est tout.Continuez. Incubez le flacon à 37 degrés.

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