Isolement du labiles complexes multi-protéiques par des In vivo Contrôlée Cellulaire réticulation et chromatographie d'affinité immuno-magnétiques

Pour la réticulation, suivie d’une immunoprécipitation. Les cellules d’intervention à une densité de 80 à 90 % sont incubées avec un millimolaire de froid glacé. DSP en PBS, calcium, magnésium ou DMSO uniquement.

Contrôle du véhicule. Le DSP est un réticulant homo bifonctionnel perméable à la membrane et qui se réticule, sans réticulation et à moins de 12 angströms l’un de l’autre. Ensuite, les cellules de réticulation sont lysées et des immunoprécipitations sont effectuées à l’aide de contrôles standard.

Les complexes protéiques sont ensuite résolus en réduisant la page SDS, réduisant le DSP clivé des agents, permettant l’identification des protéines individuelles par immuno-blot. Bonjour, je suis Stephanie Ick du laboratoire du Dr Victor Fonde au Département de biologie cellulaire de l’Université Emory. Et je suis Pearl Ryder, également du laboratoire Fonde.

Aujourd’hui, nous allons vous montrer une procédure d’isolement de complexes myprotéiques à l’aide d’une réticulation contrôlée suivie d’une chromatographie d’affinité immunomagnétique. Nous utilisons cette procédure dans notre laboratoire pour étudier les interactions transitoires entre protéines labiles. Alors commençons.

Commencez par étiqueter le bas des plaques cellulaires pour indiquer le type de cellule et la condition expérimentale spécifique. Un symbole positif indique ici que le DSP traité comprend un DMSO négatif uniquement pour le contrôle du véhicule. Ajoutez du milieu dans les plaques pour les préparer à l’ensemencement cellulaire.

Cellules HEK ensemencées à une dilution de un à cinq pour permettre l’isolement de 500 microgrammes de protéines par réaction en tube standard. Un seul tube peut suffire à identifier les partenaires de liaison présumés d’une protéine d’intérêt par immunotransfert à partir d’une analyse par spectrométrie de masse. Augmentez le nombre de réactions standard au moins 10 fois.

Préparez également des tiges de la plupart des solutions utilisées dans l’expérience de réticulation. Il s’agit notamment du PBS complété par 0,1 millimolaire de chlorure de calcium et d’un chlorure de magnésium millimolaire appelé PBS calcium-magnésium. L’ajout d’ions calcium et magnésium est essentiel pour l’adhésion des cellules à la plaque de culture.

Au cours de l’expérience, conservez la solution à quatre degrés Celsius. D’autres stocks comprennent la solution d’extinction de réticulant 50 X cocktail complet d’inhibiteurs de protéase, qui est un vortex toutes les 20 minutes jusqu’à ce que la pastille soit dissoute. 20 % de Tritan X 100, qui est stocké à quatre degrés Celsius et doit être utilisé dans un délai d’un mois et 10 x et un x Buffer a solutions.

Préparez et stockez toutes les solutions comme indiqué dans le protocole écrit qui vous accompagne. Enfin, préparez le tampon de lyse composé d’un tampon X. Un tampon de précipitation TRITTON X 100 plus 0,5 % et immunomagnétique ou tampon IP composé d’un tampon X.

A plus 0,1 % TRITTON X 101 à deux jours après le placage, les cellules ont une fluidité de 80 à 90 %, ce qui est optimal pour la réticulation. Dans des conditions de cofluence élevée, les cellules ont tendance à s’empiler les unes sur les autres, ce qui entraîne une diminution de l’accessibilité de la cellule Réticulante perméable à toutes les cellules. Remettez les plaques dans l’incubateur jusqu’à ce qu’elles soient prêtes pour la réticulation.

Préparez la solution de réticulation DSP immédiatement avant de l’appliquer sur les cellules. Le DSP est hautement hydrophobe et est donc dissous dans le DMSO à une concentration de 100 millimolaires avant d’être dilué dans le tampon calcium-magnésium PBS. Pour améliorer encore la dilution du DSP dans le tampon calcium-magnésium PBS, volume chaud et approprié, ajoutez 10 microlitres de la solution mère de DSP et de DMSO.

Pour chaque millilitre de magnésium calcique PBS chaud, ajoutez la solution mère D-S-P-D-M-S-O goutte à goutte en mélangeant à plusieurs reprises jusqu’à ce que tout le DSP soit dissous. Préparez également une solution de contrôle du véhicule de 10 microlitres de DMSO pour chaque millilitre de calcium et de magnésium PBS. Après avoir dilué le DSP, conservez toutes les solutions de calcium et de magnésium PBS dans un bain d’eau glacée pendant 10 minutes maximum.

Ensuite, préparez un bain d’eau glacée qui contiendra toutes les plaques utilisées dans l’expérience. Prenez les plaques de culture contenant les cellules de l’incubateur à 37 degrés Celsius et placez-les immédiatement dans le bain d’eau glacée. Lavez les cellules deux fois avec du calcium et du magnésium PBS glacés, en utilisant les mêmes volumes préparés précédemment pour l’incubation avec le réticulant pour six, la plaque de puits calculez deux millilitres par puits et ainsi de suite.

Après le deuxième lavage. Ajouter soit la commande du véhicule, c’est-à-dire le DMSO dissous dans la mémoire tampon, soit la solution tampon de réticulation DSP aux cellules à incuber sur de la glace pendant deux heures et vérifier environ toutes les 20 minutes pour s’assurer que toutes les cellules sont recouvertes de solution. Si certaines cellules sont exposées, inclinez et tournez la parabole pour les couvrir à nouveau uniformément, il est normal qu’une petite quantité de DSP précipite.

Au cours de l’incubation de deux heures avec les cellules avant la fin de l’incubation de deux heures, préparez une solution d’extinction XDSP en diluant la tige dans du calcium et du magnésium PBS. Maintenez la solution sur de la glace jusqu’à ce qu’elle soit utilisée pour arrêter la réaction de réticulation en inactivant le DSP qui n’a pas réagi. Lorsque les deux heures sont écoulées, retirez les solutions de contrôle du véhicule et de réticulation des cellules.

Ajoutez la solution de trempe DSP glacée et incubez sur de la glace pendant 15 minutes. Pendant ce temps, diluez le cocktail complet d’inhibiteurs de protéase de un à 50 dans le tampon de lyse cellulaire. Une fois les 15 minutes écoulées, lavez les cellules deux fois avec du calcium et du magnésium PBS.

Ajoutez ensuite le tampon de lyse contenant les inhibiteurs de protéase aux cellules et basculez à quatre degrés Celsius pendant 30 minutes. Après 30 minutes de lyse cellulaire, utilisez un grattoir cellulaire pour recueillir les cellules de la plaque. Assurez-vous de garder les lysats sur de la glace pour minimiser l’activité de la protéase.

Faites tourner la cellule lysat pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius dans une mini-centrifugeuse de paillasse à une vitesse maximale de 15 000 G. Pipetez le surnageant dans un tube frais et jetez la pastille. Analysez les niveaux de protéines à l’aide du test de Bradford et procédez à l’immunoprécipitation. Commencez à vous préparer à l’immunoprécipitation immédiatement après avoir commencé la réaction de réticulation de deux heures dans des microtubes à centrifuger à vis.

Combinez 30 microlitres de billes immunomagnétiques anti IgG avec 500 microlitres de tampon IP. Ajoutez l’anticorps contre la cible d’intérêt. La quantité appropriée d’anticorps doit être déterminée pour chaque antigène individuel.

Dans les expériences préliminaires, les contrôles négatifs possibles pour les billes comprennent l’absence d’anticorps, des billes et des billes d’anticorps de contrôle des isotypes pour lier l’anticorps IP aux billes magnétiques. Incuber dans une bascule d’extrémité d’extrémité pendant deux heures à température ambiante À la fin de l’incubation, faites tourner rapidement les tubes et glissez-les dans le support magnétique. Les billes vont se concentrer sur le côté de l’aimant.

Retirez la solution contenant les anticorps non liés et lavez immédiatement les billes pour éviter qu’elles ne se dessèchent. Après deux lavages, ajoutez 500 microlitres d’un microgramme par millilitre de lysat cellulaire DSP négatif ou DSP positif dans les tubes appropriés. Un contrôle négatif de compétition peptidique peut être préparé à ce stade en ajoutant le peptide immunogène à une concentration déterminée lors d’expériences préliminaires au mélange de billes de lysat.

Un autre contrôle négatif possible préparé à ce stade est une réaction tampon uniquement ou une réaction sans lysat préparée en ajoutant 500 microlitres de tampon de lyse uniquement aux billes. Remettez doucement les billes en suspension pour les réactions expérimentales et de contrôle. Ne faites pas de vortex car cela ferait casser les perles, incuber à quatre degrés avec une rotation de bout en bout pendant deux heures.

Au bout de deux heures, retirez le lysat à l’aide du support magnétique. Essorez et lavez rapidement les perles pour un total de six fois avec un millilitre de tampon IP. Incuber chaque lavage à quatre degrés Celsius pendant cinq minutes.

Pour échapper aux complexes liés, ajoutez un tampon d’échantillon x gel dans le tube IP juste au-dessus de la pastille de bille. Pour regrouper les billes au fond du tube, tapotez doucement le bas du tube pour remettre toutes les billes en suspension dans le tampon d’échantillon de gel. Alternativement, pour l’isolement par immuno-affinité à 30 microlitres de tampon a, complété par le peptide immunogène aux billes.

La concentration requise du peptide immunogène est déterminée empiriquement. Après avoir testé une gamme de 10 à 200 micromolaires, incubez les billes à quatre degrés pendant deux heures, tapotez les tubes toutes les 30 minutes. Utilisez le support magnétique pour retirer les 30 microlitres contenant les complexes éludés et enregistrez-les dans un tube propre avec tampon IP et enregistrez les billes.

Ajoutez un tampon d’échantillon x gel aux billes pour les deux méthodes d’élution. Chauffez les billes immunomagnétiques remises en suspension dans un tampon d’échantillon de gel à 75 degrés Celsius pendant cinq minutes en plus de dénaturer les protéines. Cette étape permettra également de déterminer la molécule DSP, ce qui permettra de résoudre les protéines individuelles dans le cadre d’une course complexe.

Les échantillons sur une page FDS gel pour le western blot. Les billes immunomagnétiques vidées peuvent être repoussées par centrifugation et retirées de l’échantillon à l’aide d’un support magnétique avant le chargement. Si l’EUA d’immuno-affinité est exempte d’IgG à la fois par coloration protéique de la page SDS ou par immuno-transferts, elle convient à la spectrométrie de masse.

Voici un exemple de transfert Western de matériel provenant de lysat cellulaire réticulé et non réticulé, suivi d’une précipitation immunomagnétique à l’aide d’un anticorps monoclonal contre la sous-unité AP trois. La réticulation delta permet de détecter des protéines en interaction qui ne sont pas observées dans les échantillons non réticulés lors des isolements immunomagnétiques. Les témoins négatifs n’ont montré aucune réduction spécifique de la protéine à l’aide d’un contrôle exempt d’anticorps et d’un contrôle à isotype d’anticorps correspondant à l’aide d’une IgG dirigée contre le récepteur de la transferrine pour les échantillons non réticulés et réticulés.

Dans cet exemple, l’élution peptidique d’affinité a été utilisée pour récupérer les protéines liées à l’anticorps IP. Notez que l’immuno-anticorps est absent dans la fraction supernat et reste dans la fraction beat pendant l’élution peptidique. Nous venons de vous montrer comment isoler des complexes MultiPro labiles à l’aide du réticulant chimique DSP, suivi d’une purification par affinité immunomagnétique.

Lors de cette procédure, il est important de garder les solutions cellulaires et les lysats refroidis pour maintenir les interactions labiles pendant la réticulation et pour minimiser l’activité de la protéase. Donc c’est tout. Merci d’avoir regardé et bonne chance dans vos expériences.