Basées sur l'ADN des espèces de poissons protocole d'identification

Le système d'identification des espèces de poissons est une méthode simple, rapide et précise basée sur l'ADN permettant d'identifier les espèces de poissons présentes dans un échantillon donné. Les échantillons de poisson sont traités avec la protéinase K afin de libérer les acides nucléiques en solution. L'ADN génomique du poisson est ensuite isolé et amplifié par PCR à l'aide d'amorces se liant à des séquences présentes dans tous les génomes de poissons.

Les produits de PCR sont ensuite digérés avec trois enzymes de restriction différentes et analysés sur un bioanalyseur Agilent 2100. Les longueurs de fragments obtenues lors des réactions de digestion peuvent être utilisées pour déterminer l'espèce de poisson à l'aide d'un logiciel d'analyse des profils de polymorphisme de la longueur des fragments de restriction, ou RFLP. Bonjour, je suis Rachel Formosa d'Agilent Technologies.

Aujourd'hui, nous allons vous présenter une procédure d'identification des espèces de poissons basée sur l'ADN. Cette procédure constitue une méthode de dépistage qui permet d'identifier les espèces de poissons présentes dans des échantillons frais, congelés, hachés, cuits, séchés ou autrement transformés. Et cela peut être réalisé en moins d'une journée de travail.

Nous utilisons cette procédure pour étudier l'authenticité des produits de la mer, ce qui est très important pour l'industrie de la pêche, car le remplacement et l'étiquetage erroné peuvent avoir des conséquences économiques, environnementales et sanitaires importantes. De plus, il peut être particulièrement difficile d'identifier l'espèce de poisson par identification visuelle ou par d'autres méthodes traditionnelles. Une fois qu'un poisson a été transformé, les tests ADN fournissent un résultat beaucoup plus précis et fiable.

Commençons. Commencez par préparer les échantillons pour l'extraction de l'ADN en plaçant de 10 à 1000 milligrammes de chaque échantillon de tissu de poisson cru ou cuit dans des tubes de microcentrifugation de 1,5 millilitre pour chaque poisson. Ajoutez 220 microlitres de solution fraîchement préparée de protéinase K et pipetez plusieurs fois vers le haut et vers le bas.

Incuber les tubes à 65 degrés Celsius pendant 10 minutes, puis centrifuger pendant trois à cinq minutes à 14 000 Gs afin de former un culot avec les tissus non digérés. Ensuite, transférer soigneusement 150 microlitres de chaque surnageant dans un nouveau tube de 1,5 millilitre, en évitant tout matériau non digéré au fond et toute matière huileuse présente en surface. Le surnageant sera désormais utilisé pour l'extraction de l'ADN génomique.

Commencez l'extraction de l'ADN génomique en ajoutant 500 microlitres du tampon de liaison des acides nucléiques à chaque échantillon. Cela portera le volume total de l'échantillon à 650 microlitres. Vortexez l'échantillon jusqu'à homogénéisation.

Ensuite, transférez chaque échantillon dans un embout de liaison à l'ADN placé dans l'un des tubes récepteurs de deux millilitres fournis dans le kit. Fermez hermétiquement le bouchon du tube sur le dessus de l'embout. Faites centrifuger les échantillons pendant une minute à 14 000 G pour fixer l'ADN sur la matrice de l'embout.

Après la centrifugation, retirez les godets de centrifugation, jetez le filtrat et replacez les godets dans les tubes réceptacles. Ajoutez 500 microlitres de tampon de lavage à haute concentration saline 1 x. Bouchonnez les tubes et centrifugez à nouveau après la centrifugation.

Jetez le filtrat et replacez à nouveau les godets de centrifugation dans les tubes réceptacles. Ajoutez maintenant 500 microlitres d'éthanol à 80 %. Bouchonnez le tube et centrifugez à 14 000 G pendant une minute.

Répétez le lavage à l'éthanol deux fois supplémentaires après le troisième lavage dans de l'éthanol à 80 %, puis jetez les filtrats. Replacez les godets de centrifugation dans les tubes réceptacles et centrifugez cette fois pendant deux minutes afin de sécher la matrice de fibres. Transférez maintenant les godets de centrifugation dans des tubes de collecte de 1,5 millilitre.

Ajouter 100 microlitres de tampon d'évolution dans chaque cupule de centrifugation directement sur la matrice fibreuse à l'intérieur de la cupule. Ensuite, fixer hermétiquement les bouchons des tubes de collecte sur les cupules de centrifugation et incuber à température ambiante pendant une minute. Après l'incubation, centrifuger les échantillons à vitesse maximale pendant une minute.

Ensuite, jetez la cupette de centrifugation et fermez les tubes. Si les concentrations d'ADN sont mesurées, des concentrations allant de cinq nanogrammes par microlitre à 500 nanogrammes par microlitre sont attendues. L'ADN peut maintenant être conservé à quatre degrés Celsius pendant un mois maximum ; pour une conservation à long terme, placez l'ADN à moins 20 ou moins 80 degrés Celsius.

Réalisez une PCR en utilisant les amorces et les réactifs fournis dans le kit de réactifs P-C-R-R-F-L-P. Selon le protocole écrit fourni, il est recommandé d'effectuer chaque échantillon, y compris le contrôle positif et le contrôle sans matrice, en double pendant l'exécution de la PCR. Préparez les mélanges maîtres d'enzymes de restriction pour les digestions avec DTE E one HAE three et NL three en combinant les composants suivants dans l'ordre : 1,5 microlitre d'eau distillée stérile, 0,5 microlitre de tampon enzymatique 10 x et 0,5 microlitre d'enzyme 10 x.

Préparez suffisamment pour tous les échantillons plus un volume de réaction excédentaire pour le mélange réactif quatre trois. Ensuite, distribuez 2,5 µL dans chaque tube de réaction étiqueté avec le nom de l'échantillon et de l'enzyme. Une fois la PCR terminée, retirez les échantillons du thermocycleur et placez-les sur de la glace.

Ajoutez 2,5 microlitres de chaque produit PCR dans chacun des trois tubes de digestion par restriction pour cette réaction. DDE un, HAE trois et NLA trois. Ensuite, vortexez.

Centrifuger brièvement et incuber les digestions à 37 degrés Celsius pendant deux heures. Si cela est plus pratique, les digestions peuvent également être incubées toute la nuit. Après la digestion, incuber les réactions à 65 degrés Celsius pendant 15 minutes.

Ensuite, ajouter un microlitre de EDTA à 60 millimolaire dans chaque tube pour arrêter la réaction, puis vortexer. À l'aide du kit de réactifs Agilent Bioanalyzer, préparer et charger le produit de digestion dans les puits d'une puce d'ADN selon le guide du kit. Pour chaque échantillon, les trois digestions doivent être chargées sur la même puce.

Ensuite, vortexez la puce et chargez-la dans la machine. Une fois l'analyse terminée, accédez au contexte du test et sélectionnez l'onglet résumé de la puce. Dans le champ nom de l'échantillon, saisissez un nom d'échantillon pour les 12 puits de la puce afin d'identifier l'espèce de poisson des échantillons d'ADN testés.

Lancez le programme de décodage RFLP en cliquant sur Fichier, puis ouvrez le fichier XAD. La boîte de dialogue d'ouverture s'affichera.

Sélectionnez maintenant le fichier XAD pour la puce à ADN utilisée. Cliquez sur « Ouvrir » pour afficher une liste des échantillons chargés sur la puce. Sélectionnez les trois digestions correspondant au premier échantillon d'ADN.

Dans la colonne enzyme, indiquez les enzymes de restriction qui ont été utilisées dans le champ intitulé hauteur de pic minimale en pourcentage du marqueur inférieur. La valeur par défaut est de 10 % si nécessaire. Cette valeur peut être réduite afin d'identifier de petits pics manqués ou augmentée pour éliminer les pics résultant d'un bruit non spécifique dans l'électrophérogramme.

Après avoir effectué des ajustements sur la valeur de hauteur minimale du pic, cliquez sur réintégrer. Cliquez ensuite sur calculer au bas de la boîte de dialogue. Les données de longueur des fragments obtenues à partir de l'analyse sur le bioanalyseur rempliront les champs du logiciel.

Ensuite, dans la liste déroulante « score » située dans le coin supérieur gauche de l'écran, sélectionnez « dé ». Si l'échantillon de poisson est constitué d'une seule espèce de poisson ou d'un mélange, et si l'échantillon peut être un mélange, consultez le tableau au bas de l'écran intitulé « liste des scores combinés ». Les meilleures correspondances d'espèces sont basées sur les résultats des trois réactions de digestion.

Les correspondances parfaites avec un score de un sont mises en surbrillance en vert. Les correspondances approximatives sont mises en surbrillance en jaune en haut de l'écran. La valeur de seuil inférieur désigne la taille minimale du fragment utilisée dans l'analyse, et la valeur de tolérance de correspondance détermine à quel point la longueur d'un fragment doit être proche de celle du fragment prédit pour être considérée comme une correspondance.

Les valeurs indiquées sont les paramètres par défaut et peuvent être ajustées. Répétez ces étapes pour l'analyse des échantillons d'ADN restants sur la pointe. Des échantillons d'ADN provenant de quatre espèces de poissons différentes ont été isolés, amplifiés et digérés en utilisant la méthode décrite dans cette vidéo.

Un gel de bioanalyseur montrant les échantillons de digestion par restriction est présenté ici à l'aide du Bioanalyzer d'Agilent et du décodeur RFLP. Des profils logiciels de migration sont utilisés pour identifier les poissons. Le premier échantillon est correctement identifié comme étant de la truite, le deuxième comme du thon, le troisième comme du rockfish.

Et le dernier échantillon comme cabillaud spécifique. Nous venons de vous montrer comment effectuer une identification des espèces de poissons par ADN en utilisant la méthode P-C-R-R-F-L-P d'Agilent. Lors de cette procédure, il est important d'éviter toute contamination croisée des échantillons, car la méthode est très sensible.

Voilà donc tout ce qu'il faut savoir. Vous savez désormais comment identifier rapidement, facilement et précisément les espèces de poissons présentes dans vos échantillons. Merci d'avoir regardé et bonne chance dans vos expériences.