Name: Basées sur lADN des espèces de poissons protocole didentification (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-04-28T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 15 s
Description: Découvrez une méthode d'identification des espèces de poissons basée sur l'ADN utilisant PCR et analyse RFLP. Ce protocole permet d'authentifier les produits de la mer rapidement et avec précision.

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Agilent produits de Stratagene Division <ul><li> Ravi Harini </li><li> Natalia Novorodovskaya </li><li> Scott Basehore </li><li> Jeff Braman </li><li> Rachel Formosa </li><li> Ronda Allen </li><li> Rajesh Bagga </li><li> Derek Hall </li><li> Sarah Jandle </li><li> Danielle Huffman </li></ul> Laboratoires Agilent <ul><li> Robert Kincaid </li><li> Mary McBride </li></ul> Agilent en Europe <ul><li> Nigel Skinner </li><li> Juergen Schneider </li><li> Stephen Mueller </li><li> Martin Kratzmeier </li></ul> Campden BRI <ul><li> Steve Garrett </li></ul>

<ol><li>Dooley, J. J., Sage, H. D., Brown, H. M., Garrett, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+fish+species+identification+by+use+of+lab-on-a-chip+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Control%22%5BJournal%5D)">Improved fish species identification by use of lab-on-a-chip technology.</a> Food Control. 16 (7), 601-607 (2004).</li>
<li>Dooley, J. J., Sage, H. D., Clarke, M. -A. L., Brown, H. M., Garrett, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fish+species+Identification+Using+PCR-RFLP+Analysis+and+Lab-on-a-Chip+Capillary+Electrophoresis%3A+Application+to+Detect+White+Fish+Species+in+Food+Products+and+an+Interlaboratory+Study%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Agric.+Food+Chem%22%5BJournal%5D)">Fish species Identification Using PCR-RFLP Analysis and Lab-on-a-Chip Capillary Electrophoresis: Application to Detect White Fish Species in Food Products and an Interlaboratory Study.</a> J. Agric. Food Chem. 53, 3348-3357 (2005).</li>
<li>Dooley, J., Garrett, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+PCR-RFLP+Profiles+for+Fish+Species+Using+the+Agilent+2100+Bioanalyzer%5BTitle%5D)+AND+%22Agilent+Technologies+Application+Note%22%5BJournal%5D)">Determination of PCR-RFLP Profiles for Fish Species Using the Agilent 2100 Bioanalyzer.</a> Agilent Technologies Application Note. , (2005).</li>
<li>Dooley, J. J., Clarke, M. L., Sage, H. D., Brown, H. M., Garrett, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+a+chip-based+capillary+electrophoresis+system+to+enable+simple+PCR-RFLP+identification+of+fish+species%5BTitle%5D)+AND+%22FSA+Final+Report+Q01069%22%5BJournal%5D)">Application of a chip-based capillary electrophoresis system to enable simple PCR-RFLP identification of fish species.</a> FSA Final Report Q01069. , (2004).</li>
</ol>

Les auteurs sont employés par Agilent Technologies, qui produit les réactifs et les instruments utilisés dans cet article.

Nous démontrons une méthode de dépistage simple, rapide et précis à base d&#39;ADN pour l&#39;identification des espèces de poissons dans des produits marins. Cette méthode puissante fournit reproductibles, des résultats précis en moins d&#39;une journée de travail et il peut être mis en œuvre dans les installations d&#39;essais commerciaux en raison de protocoles rationalisée et une configuration simple. Elle est caractérisée par la production de données objectives qui est analysée par RFLP décodeur logiciel avec une base de données extensible de façon expérimentale dérivée des profils des espèces de poissons. Avec la mise en œuvre de routine, cette méthode d&#39;essai a le potentiel de prévenir mauvais étiquetage des produits de la mer et les aider à maintenir des dossiers précis adapté à la conformité aux réglementations gouvernementales.

<table><tbody><tr><td>Agilent 2100 Bioanalyzer (avec station de amorçage de puces et agitateur vortex IKA)</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2939AA</td><td></td></tr><tr><td>Ordinateur portable Agilent 2100 Bioanalyzer &amp;amp; logiciel expert</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2953CA</td><td>G2950CA - ordinateur de bureau &amp;amp; logiciel expert</td></tr><tr><td>Kit de réactifs Agilent Bioanalyzer ADN 1000 (réf. 5067-1504)</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-1504</td><td></td></tr><tr><td>Thermocycleur</td><td>Divers</td><td>Divers</td><td></td></tr><tr><td>Tubes en bande pour PCR</td><td>Agilent Technologies</td><td>401428</td><td></td></tr><tr><td>Couvercles de bandelettes PCR</td><td>Agilent Technologies</td><td>401425</td><td></td></tr><tr><td>Bac de travail à 96 puits</td><td>Agilent Technologies</td><td>410094</td><td></td></tr><tr><td>Kit d'isolement d'ADN pour le système d'identification des espèces de poissons</td><td>Agilent Technologies</td><td>Contact</td><td></td></tr><tr><td>Kit de réactifs pour le système d'identification des espèces de poissons par PCR-RFLP</td><td>Agilent Technologies</td><td>Contact</td><td></td></tr><tr><td>Logiciel RFLP Matcher</td><td>Agilent Technologies</td><td>Contact</td><td></td></tr><tr><td>Éthanol à 100 %, 200 preuves (qualité USP ou équivalente)</td><td>Divers</td><td>Divers</td><td></td></tr><tr><td>Eau stérile, sans nucléase</td><td>Divers</td><td>Divers</td><td></td></tr><tr><td>Pipettes</td><td>Divers</td><td>Divers</td><td></td></tr><tr><td>Incubateur ou bain-marie réglé à 65&amp;#x00B0;C</td><td>Divers</td><td>Divers</td><td></td></tr><tr><td>Bouteille en verre stérile ou tube en polypropylène (par exemple, tube en polypropylène BD Falcon de 14 ml)</td><td>Divers</td><td>Divers</td><td></td></tr><tr><td>tubes à fond rond ou tubes coniques en polypropylène BD Falcon de 50 ml</td><td>Divers</td><td>Divers</td><td></td></tr><tr><td>Agitateur vortex</td><td>Divers</td><td>Divers</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifugeuse</td><td>Divers</td><td>Divers</td><td></td></tr><tr><td>Tubes de microcentrifugeuse de 1,5 ml</td><td>Divers</td><td>Divers</td><td></td></tr><tr><td>Support pour tubes de 1,5 ml</td><td>Divers</td><td>Divers</td><td></td></tr><tr><td>Embouts de pipette</td><td>Divers</td><td>Divers</td><td></td></tr></tbody></table>

basées sur l&#39;adn des espèces de poissons protocole d&#39;identification

DNA-based Fish Species Identification Protocol

Nous avons développé une méthode de dépistage rapide, simple et précis basé sur l&#39;ADN pour identifier les espèces de poissons présentes dans les échantillons de fruits de mer frais et transformés. Cette méthode polyvalente emploie amplification par PCR de l&#39;ADN génomique extrait à partir d&#39;échantillons de poisson, suivie par la longueur des fragments de restriction du polymorphisme (RFLP) pour générer des motifs fragment qui peut être résolu sur le bioanalyseur Agilent 2100 et appariés pour l&#39;espèce correcte en utilisant le logiciel correspondant motif de RFLP. La méthode d&#39;identification des poissons utilise un simple, fiable, spin colonne basée sur le protocole pour isoler l&#39;ADN d&#39;échantillons de poissons. Les échantillons sont traités à la protéinase K pour libérer les acides nucléiques en solution. L&#39;ADN est ensuite isolé par la suspension de l&#39;échantillon dans un tampon de liaison et le chargement sur une tasse de micro-tour contenant une matrice de fibres à base de silice. Les acides nucléiques dans l&#39;échantillon se lient à la matrice de fibres. Les acides nucléiques immobilisés sont lavés pour éliminer les contaminants, et l&#39;ADN total est récupéré dans un volume final de 100 pl. L&#39;ADN isolé est prêt pour l&#39;amplification par PCR avec les amorces fournies qui se lient à des séquences trouvées dans tous les génomes de poisson. Les produits de PCR sont ensuite digéré par trois enzymes de restriction différentes et résolues sur le bioanalyseur Agilent 2100. Les longueurs fragment produits dans les réactions de digestion peuvent être utilisées pour déterminer les espèces de poissons à partir de laquelle l&#39;échantillon d&#39;ADN a été préparé en utilisant le modèle RFLP logiciels de correspondance contenant une base de données des profils RFLP expérimentalement provenant d&#39;espèces de poissons commercialement pertinents.

Cette publication décrit comment utiliser le poisson Espèces d&#39;Agilent Système d&#39;identification d&#39;identifier les espèces de poisson en extrayant de l&#39;ADN et la PCR et effectuer l&#39;analyse RFLP.

Basées sur l&#39;ADN des espèces de poissons protocole d&#39;identification

Nous avons mis au point une méthode de dépistage rapide, simple et précise, basée sur l'ADN, permettant d'identifier les espèces de poissons présentes dans des échantillons de produits de la mer frais et transformés. ...

Le système d'identification des espèces de poissons est une méthode simple, rapide et précise basée sur l'ADN permettant d'identifier les espèces de poissons présentes dans un échantillon donné. Les échantillons de poisson sont traités avec de la protéinase K afin de libérer les acides nucléiques en solution. L'ADN génomique du poisson est ensuite isolé et amplifié par PCR à l'aide d'amorces qui se lient à des séquences présentes dans tous les génomes de poissons.Les produits de PCR sont ensuite digérés avec trois enzymes de restriction différentes et analysés sur un bioanalyseur Agilent 2100. Les longueurs des fragments obtenus lors des réactions de digestion peuvent être utilisées pour déterminer l'espèce de poisson à l'aide d'un logiciel d'analyse des profils de polymorphisme de la longueur des fragments de restriction, ou RFLP. Bonjour, je suis Rachel Formosa d'Agilent Technologies.Aujourd'hui, nous allons vous présenter une procédure d'identification des espèces de poissons fondée sur l'ADN. Cette procédure constitue une méthode de dépistage qui permet d'identifier les espèces de poissons présentes dans des échantillons frais, congelés, hachés, cuits, séchés ou autrement transformés. Et cela peut être réalisé en moins d'une journée de travail.Nous utilisons cette procédure pour étudier l'authenticité des produits de la mer, ce qui est très important pour l'industrie halieutique, car le remplacement et l'étiquetage erroné peuvent avoir des conséquences économiques, environnementales et sanitaires importantes. De plus, il peut être particulièrement difficile d'identifier les espèces de poissons par l'identification visuelle et d'autres méthodes traditionnelles. Une fois qu'un poisson a été transformé, l'analyse ADN fournit un résultat beaucoup plus précis et fiable.Commençons. Préparez les échantillons pour l'extraction d'ADN en plaçant de 10 à 1000 milligrammes de chaque échantillon de tissu de poisson cru ou cuit dans des tubes de microcentrifugation de 1,5 millilitre par poisson. Ajoutez 220 microlitres de solution fraîchement préparée de protéinase K et pipetez plusieurs fois vers le haut et vers le bas.Incuber les tubes à 65 degrés Celsius pendant 10 minutes, puis centrifuger après l'incubation pendant trois à cinq minutes à 14 000 Gs pour former un culot avec les tissus non digérés. Ensuite, transférer soigneusement 150 microlitres de chaque surnageant dans un nouveau tube de 1,5 millilitre, en évitant tout matériau non digéré au fond et tout matériau huileux présent en surface. Le surnageant sera désormais utilisé pour l'extraction de l'ADN génomique.Commencez l'extraction de l'ADN génomique en ajoutant 500 microlitres du tampon de liaison des acides nucléiques à chaque échantillon. Cela portera le volume total de l'échantillon à 650 microlitres. Vortexez l'échantillon jusqu'à homogénéisation.Ensuite, transférez chaque échantillon dans un embout de liaison à l'ADN placé dans l'un des deux tubes récepteurs d'un millilitre fournis dans le kit. Fermez hermétiquement le bouchon du tube sur le dessus de l'embout. Faites centrifuger les échantillons pendant une minute à 14 000 G pour fixer l'ADN sur la matrice de l'embout. Après la centrifugation, retirez les godets de centrifugation, jetez le filtrat et replacez les godets dans les tubes récepteurs. Ajoutez 500 microlitres de tampon de lavage à haute concentration saline 1 x. Bouchonnez les tubes et centrifugez à nouveau après la centrifugation.Jetez le filtrat et replacez à nouveau les godets de centrifugation dans les tubes réceptacles. Ajoutez maintenant 500 microlitres d'éthanol à 80 %. Boucher le tube et centrifuger à 14 000 G pendant une minute.Répétez le lavage à l'éthanol deux fois supplémentaires après le troisième lavage dans de l'éthanol à 80 %, puis jetez les filtrats. Replacez les godets de centrifugation dans les tubes réceptacles et centrifugez cette fois pendant deux minutes afin de sécher la matrice de fibres. Transférez ensuite les godets de centrifugation dans des tubes de collecte de 1,5 millilitre.Ajouter 100 microlitres de tampon d'évolution dans chaque cupule de centrifugation directement sur la matrice fibreuse à l'intérieur de la cupule. Ensuite, fixer hermétiquement les bouchons des tubes de collecte sur les cupules de centrifugation et incuber à température ambiante pendant une minute. Après l'incubation, centrifuger les échantillons à vitesse maximale pendant une minute.Ensuite, jetez le godet de centrifugation et fermez les tubes. Si les concentrations d'ADN sont mesurées, des concentrations allant de cinq nanogrammes par microlitre à 500 nanogrammes par microlitre sont attendues. L'ADN peut désormais être conservé à quatre degrés Celsius pendant un mois au maximum ; pour une conservation à long terme, placez l'ADN à moins 20 ou moins 80 degrés Celsius.Réalisez une PCR en utilisant les amorces et les réactifs fournis dans le kit de réactifs P-C-R-R-F-L-P. Selon le protocole écrit fourni, il est recommandé d'effectuer chaque échantillon, y compris le contrôle positif et le contrôle sans matrice, en double pendant l'exécution de la PCR. Préparez les mélanges maîtres d'enzymes de restriction pour les digestions avec DTE E one HAE three et NL three en combinant les composants suivants dans l'ordre : 1,5 microlitre d'eau distillée stérile, 0,5 microlitre de tampon enzymatique 10 x et 0,5 microlitre d'enzyme 10 x.Préparez une quantité suffisante pour tous les échantillons plus un volume de réaction excédentaire du mélange réactif trois pour quatre. Ensuite, distribuez 2,5 µL dans chaque tube de réaction étiqueté avec le nom de l'échantillon et de l'enzyme. Une fois la PCR terminée, retirez les échantillons du thermocycleur et placez-les sur de la glace.Ajouter 2,5 microlitres de chaque produit PCR dans chacun des trois tubes de digestion par restriction pour cette réaction. DDE un, HAE trois et NLA trois. Ensuite, vortexer.Centrifuger brièvement et incuber les digestions à 37 degrés Celsius pendant deux heures. Si cela est plus pratique, les digestions peuvent également être incubées toute la nuit. Après la digestion, incuber les réactions à 65 degrés Celsius pendant 15 minutes.Ensuite, ajouter un microlitre de EDTA à 60 millimolaire dans chaque tube pour arrêter la réaction, puis vortexer. À l'aide du kit de réactifs Agilent Bioanalyzer, préparer et charger le produit de restriction dans les puits d'une puce ADN selon le guide du kit. Pour chaque échantillon, les trois digestions doivent être chargées sur la même puce.Ensuite, vortexez la puce et chargez-la dans la machine. Une fois l'analyse terminée, accédez au contexte du test et sélectionnez l'onglet résumé de la puce. Dans le champ nom de l'échantillon, saisissez un nom d'échantillon pour les 12 puits de la puce afin d'identifier l'espèce de poisson des échantillons d'ADN testés.Lancez le programme de décodage RFLP en cliquant sur Fichier, puis ouvrez le fichier XAD. La boîte de dialogue d'ouverture s'affichera.Sélectionnez maintenant le fichier XAD pour la puce à ADN utilisée. Cliquez sur « Ouvrir » pour afficher une liste des échantillons chargés sur la puce. Sélectionnez les trois digestions correspondant au premier échantillon d'ADN.Dans la colonne « enzyme », indiquez les enzymes de restriction qui ont été utilisées dans le champ intitulé « hauteur de pic minimale » exprimée en pourcentage du marqueur inférieur. La valeur par défaut est de 10 % si nécessaire. Cette valeur peut être abaissée afin d'identifier des pics plus petits qui auraient été manqués, ou augmentée pour éliminer les pics résultant d'un bruit non spécifique dans l'électrophérogramme.Après avoir effectué des ajustements de la valeur minimale de hauteur de pic, cliquez sur réintégrer. Cliquez ensuite sur calculer au bas de la boîte de dialogue. Les données de longueur des fragments obtenues à partir de l'analyse sur le bioanalyseur rempliront les champs du logiciel.Ensuite, dans la liste déroulante « score » située dans le coin supérieur gauche de l'écran, sélectionnez « dé ». Si l'échantillon de poisson est constitué d'une seule espèce de poisson ou d'une mixture, et si l'échantillon peut être un mélange, consultez le tableau au bas de l'écran intitulé « liste des scores combinés ». Les meilleures correspondances d'espèces sont basées sur les résultats des trois réactions de digestion.Les correspondances parfaites avec un score de un sont mises en surbrillance en vert. Les correspondances approximatives sont mises en surbrillance en jaune en haut de l'écran. La valeur seuil inférieure désigne la taille minimale du fragment utilisée dans l'analyse, et la valeur de tolérance de correspondance détermine à quel point la longueur d'un fragment doit être proche de celle du fragment prédit pour être considérée comme une correspondance.Les valeurs indiquées sont les paramètres par défaut et peuvent être ajustées. Répétez ces étapes pour l'analyse des échantillons d'ADN restants sur la pointe. Des échantillons d'ADN provenant de quatre espèces de poissons différentes ont été isolés, amplifiés et digérés en utilisant la méthode décrite dans cette vidéo.Un gel de bioanalyseur montrant les échantillons de digestion par restriction est présenté ici à l'aide du Bioanalyzer d'Agilent et du décodeur RFLP. Des profils logiciels de bandes sont utilisés pour identifier les poissons ici. Le premier échantillon est correctement identifié comme étant de la truite, le deuxième comme du thon, le troisième comme de la rocaille.Et le dernier échantillon comme cabillaud spécifique. Nous venons de vous montrer comment effectuer une identification des espèces de poissons par ADN en utilisant la méthode P-C-R-R-F-L-P d'Agilent. Lors de cette procédure, il est important d'éviter toute contamination croisée des échantillons, car la méthode est très sensible.Voilà donc tout ce qu'il faut savoir. Vous savez désormais comment identifier rapidement, facilement et avec précision les espèces de poissons présentes dans vos échantillons. Merci d'avoir regardé et bonne chance dans vos expériences.

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