Développement de l'imagerie automatisée et d'analyse pour les écrans chimiques du poisson zèbre.

Dans cette vidéo, un criblage image fondé sur un haut contenu est réalisé afin d'évaluer la modulation par de petites molécules de la voie de signalisation du facteur de croissance des fibroblastes Rasm map kinase chez des embryons de poisson zèbre. Des poissons zèbres transgéniques mâles et des femelles sauvages sont accouplés dans une cage de reproduction. Les œufs fécondés tombent au fond et sont collectés puis transférés dans une boîte de Pétri. Les embryons sont incubés toute la nuit, puis placés dans des puits individuels d'une plaque de 96 puits à fond rond.

La petite molécule BCI est ajoutée afin d'hyperactiver la signalisation FGF et la plaque est incubée pendant six heures. Des images de chaque puits sont capturées à l'aide d'un lecteur de plaques confocal et analysées à l'aide d'un algorithme conçu par nos soins, qui fournit les intensités de fluorescence dans des structures embryonnaires spécifiques. Bonjour, je suis Hiba Kado du laboratoire du Dr Michael Chang au Département de microbiologie et de génétique moléculaire de l'Université de Pittsburgh.

Bonjour, je suis Andrea Spock de l'Institut de découverte de médicaments de l'Université de Pittsburgh. Aujourd'hui, nous allons vous montrer la procédure d'élevage, de sélection et de disposition de blastocystes de poisson zèbre pour un traitement chimique. Dans une plaque de 96 puits, nous utiliserons des embryons transgéniques qui rendent compte de l'activité du facteur de croissance des fibroblastes et que nous traiterons avec une molécule activant fortement cette voie.

Nous allons vous montrer comment nous utilisons la méthodologie de criblage à haut contenu pour acquérir, analyser et quantifier automatiquement l'activité du facteur de croissance des fibroblastes chez des embryons de poisson-zèbre transgéniques. Cette procédure mettra en évidence une technologie de plateforme permettant d'utiliser des poissons-zèbres transgéniques et des criblages chimiques à haut débit. Commençons donc.

Deux jours avant le traitement, identifier les poissons-zèbres transgéniques mâles homozygotes et les placer dans des aquariums d'accouplement individuels. Ajouter des séparateurs dans les aquariums, puis ajouter un poisson femelle de type sauvage dans chaque aquarium et laisser les poissons dans les cages d'accouplement toute la nuit à 28 degrés Celsius. Le lendemain matin, retirer le séparateur. Après une heure, transférer les poissons dans un nouvel aquarium et verser les embryons dans une passoire en plastique.

Transférez les embryons dans des boîtes de 100 millimètres contenant la solution E3 et incubez-les à 28 degrés Celsius pendant six à huit heures. Après l'incubation, examinez les embryons au microscope stéréo. Les embryons appropriés pour les expériences seront en cours de gastrulation.

À ce stade, retirez tous les embryons non fécondés, qui demeureront au stade de cellule unique. Retirez également les embryons non viables qui apparaissent opaques ou malformés. Ajoutez ensuite une solution E3 fraîche et incubez toute la nuit à 28 degrés Celsius.

Le lendemain, placer les embryons sous un microscope stéréo à fluorescence pour trier les embryons transgéniques selon un stade similaire et une expression uniforme de la GFP. À 24 HPF, les embryons présentent une limite visible entre le mésencéphale et le métencéphale, une forte expression de la GFP et des yeux bien formés avec des rétines dorsales GFP-positives. Ces embryons sont actifs et bougent ou gigotent dans leur chorion ; utiliser une pipette Pasteur en plastique.

Transférez les embryons de 24 HPF un par un dans des puits individuels d'une plaque de 96 puits. À l'aide d'une micropipette, retirez toute solution E3 en excès des puits. Ensuite, à l'aide d'une pipette multipuits, ajoutez 200 microlitres de solution E3 dans chaque puits.

Ensuite, ajoutez deux microlitres de DMSO dans tous les puits des colonnes un et 12. Puis ajoutez deux microlitres de BCL préparé dans du DMSO selon les concentrations suivantes : un micromolaire dans les colonnes deux et sept, cinq micromolaires dans les colonnes trois et huit, 10 micromolaires dans les colonnes quatre et neuf, 20 micromolaires.

Micromolaire dans les colonnes cinq et dix. Et enfin, 25 micromolaire dans la colonne six et onze. Recouvrez maintenant la plaque avec du papier d'aluminium et incubez-la pendant six heures à 28 degrés Celsius.

Ajoutez 10 microlitres de trica dans chaque puits pour anesthésier les embryons à 30 HPF. Ensuite, chargez la plaque dans le logiciel molecular devices image express ultra open meta express. Choisissez une configuration avec un objectif Forex et un diamètre de diaphragme maximal.

Configurer la mise au point automatique du laser pour détecter le fond de la plaque et utiliser un décalage Z optimal prédéterminé. Pour détecter les régions d'intérêt, définir la zone de balayage comme un site unique de 2000 sur 2000 pixels sans bégaiement. Sélectionner le type de plaque approprié ainsi que le laser à argon de 488 nanomètres avec une excitation à 488 nanomètres et une émission à 525 nanomètres.

Ensuite, sélectionnez un puits contenant un embryon traité au véhicule et cliquez sur « trouver l'échantillon ». L'appareil effectuera une analyse de mise au point automatique et acquerra une seule image afin de confirmer une acquisition correcte. Choisissez aléatoirement un puits traité au véhicule et acquérez une image.

Si l'image est nette et montre une expression de la GFP dans la tête. Placer le curseur sur les zones les plus brillantes et vérifier que l'intensité de fluorescence est comprise dans la plage de la caméra 16 bits. Inférieure à 65 000 unités.

Répétez ces étapes avec un autre puits contrôle véhicule et quelques puits traités au composé. Si nécessaire, ajustez la puissance du laser et le gain de manière à ce que les régions les plus brillantes des images du contrôle positif ne soient pas saturées. Ensuite, dans la fenêtre d'acquisition de la plaque et de contrôle, sélectionnez acquérir la plaque pour démarrer la numérisation de la plaque.

L'appareil acquerra automatiquement une image par puits pour toute la microplaque et les archivera dans une base de données SQL. Une fois le balayage terminé, transférez les images dans D definition's Developer en ouvrant Developer avec l'option slinger activée.

Créez un nouvel espace de travail. Ensuite, dans le menu fichier, sélectionnez l'importation personnalisée. Puis, accédez au dossier contenant les images et ouvrez un fichier exemple.

Choisissez un filtre d'importation qui reconnaît le format d'image et la structure de fichier générés par la plateforme d'appareils moléculaires ImageXpress Ultra. Pour traiter les images, ouvrez maintenant une image témoin et chargez la technologie de réseau cognitif souhaitée, ou algorithme CNT, ou jeu de règles. L'algorithme personnalisé utilisé ici est conçu pour identifier automatiquement l'embryon, le vitellus et la tête, et pour quantifier la luminosité et la surface des structures de la tête exprimant la GFP ; exécutez le jeu de règles jusqu'à l'étape de détection de la tête et du vitellus.

Pour garantir une attribution correcte du sac vitellin et de la tête, modifiez l'ensemble de règles afin d'ajuster le seuil de détection du vitellus si celui-ci est trop grand ou trop petit. Ensuite, exécutez l'ensemble de règles jusqu'à l'étape de détection des structures brillantes de la tête. Pour assurer une attribution adéquate des régions exprimant GFP dans la tête, modifiez l'ensemble de règles afin d'ajuster le seuil de détection des structures de la tête en multiples de l'intensité moyenne, jusqu'à ce que la détection des structures brillantes de la tête corresponde à l'observation visuelle.

Ensuite, exécutez manuellement l'ensemble complet des règles sur plusieurs images choisies aléatoirement parmi celles générées à partir d'embryons traités au véhicule et sur des images de contrôle positif provenant d'embryons traités au PCI. Pour exécuter l'algorithme sur toutes les images des plaques, sélectionnez les plaques à analyser et choisissez Analyser, puis accédez à l'ensemble de règles optimisé et analysez tous les puits.

Grâce au planificateur de tâches intégré, les puits vides ou les images ambigües sont automatiquement exclus de l'analyse pendant le balayage. Une carte de conservation en cours de mise à jour est affichée. Les données et les images sont accessibles pendant l'exécution pour un examen visuel.

Les données numériques et les images traitées sont automatiquement enregistrées. Une fois que toutes les images ont été analysées, les données peuvent être exportées vers des logiciels tiers tels qu'Excel, GraphPad ou Prism. Cette figure montre des images de scan archivées provenant d'un puits traité au véhicule et d'un puits traité au BCI, avec et sans analyse CNT.

La protéine fluorescente verte, ou GFP, appliquée est détectée dans l’œil, la limite entre le mésencéphale et le métencéphale, ainsi que dans les ganglions trijumeaux d’embryons transgéniques. Remarquez que l’intensité de la GFP et les domaines d’expression sont tous deux élargis. Chez les embryons traités au BCI présentés ici, on observe un effet dose-dépendant du BCI sur l’expression du gène rapporteur GFP dans les embryons transgéniques.

La concentration nécessaire pour obtenir une réponse maximale à moitié, ou CE 50, était d'environ 12 micromolaire. Nous venons de vous montrer comment élever, collecter et disposer des embryons de poisson-zèbre transgéniques dans des plaques de 96 puits. Nous avons ajouté des concentrations croissantes de PCI dans notre activateur de la voie de signalisation.

Nous avons également montré comment automatiser l’imagerie d’embryons transgéniques et avons analysé les images à l’aide d’un algorithme sur mesure basé sur la technologie de réseau cognitif. Grâce à cette approche, nous avons pu mesurer de manière quantitative et progressive les effets d’un petit activateur moléculaire de la signalisation du facteur de croissance des fibroblastes. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de bien choisir les embryons afin de minimiser la variabilité entre les échantillons.

C'est tout. Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.