Name: Développement de limagerie automatisée et danalyse pour les écrans chimiques du poisson zèbre. (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-06-24T17:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 49 s
Description: Découvrez l'imagerie automatisée pour les cribles chimiques chez Danio rerio. Cette méthode quantifie les effets dose-dépendants des petites molécules sur la signalisation FGF en utilisant un lecteur confocal et un algorithme personnalisé.

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Ce travail est financé par le NICHD / NIH (1R01HD053287) pour Hukriede, NCI / NIH (P01 CA78039) Vogt, et NHLBI / NIH (1R01HL088016) pour Tsang.

1) Mettre en place des accouplements de poisson zèbre et le traitement de BCI. <ol><li> Deux jours avant le traitement, identifier les homozygotes mâles Tg (dusp6: d2eGFP) PT6 poisson zèbre et le lieu individuellement dans une réservoirs d'accouplement. Ajouter séparateur et un type de poisson sauvage AB * femelle et laisser dans des cages d'accouplement pendant la nuit. </li><li> Le lendemain matin enlever le séparateur, et de recueillir des embryons après 1 heure. Transfert des embryons à des plats 100mm avec l'E3 (5 mM de NaCl, 0,17 mM de KCl, 0,33 mM de CaCl2, 0,33 mM MgSO4), solution et incuber à 28 ° C pendant 6 heures. Retirer morts et non fécondés embryons, ajouter la solution E3 frais, et incuber pendant la nuit. </li><li> Trier embryons transgéniques pour le stade similaire (24hpf) et expression de la GFP uniforme. Embryons tableau individuellement dans chaque puits d'une plaque de 96 puits. </li><li> Retirer l'excédent de solution E3 avec une micropipette. Ajouter 200 ul de solution E3 avec une pipette multi-canaux dans chaque puits. </li><li> Ajouter les composés énumérés ci-après: <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> 1 </td><td> 2 </td><td> 3 </td><td> 4 </td><td> 5 </td><td> 6 </td><td> 7 </td><td> 8 </td><td> 9 </td><td> 10 </td><td> 11 </td><td> 12 </td></tr><tr><td> Une </td><td> 2μl DMSO </td><td> 2μl BCl (0.1mm) </td><td> 2μl BCl (0.5mm) </td><td> 2μl BCl (1 mM) </td><td> 2μl BCl (2mm) </td><td> 2μl BCl (2.5mm) </td><td> 2μl BCl (0.1mm) </td><td> 2μl BCl (0.5mm) </td><td> 2μl BCl (1 mM) </td><td> 2μl BCl (2mm) </td><td> 2μl BCl (2.5mm) </td><td> 2μl DMSO </td></tr><tr><td> B </td><td> 2μl DMSO </td><td> 2μl BCl (0.1mm) </td><td> 2μl BCl (0.5mm) </td><td> 2μl BCl (1 mM) </td><td> 2μl BCl (2mm) </td><td> 2μl BCl (2.5mm) </td><td> 2μl BCl (0.1mm) </td><td> 2μl BCl (0.5mm) </td><td> 2μl BCl (1 mM) </td><td> 2μl BCl (2mm) </td><td> 2μl BCl (2.5mm) </td><td> 2μl DMSO </td></tr><tr><td> C </td><td> 2μl DMSO </td><td> 2μl BCl (0.1mm) </td><td> 2μl BCl (0.5mm) </td><td> 2μl BCl (1 mM) </td><td> 2μl BCl (2mm) </td><td> 2μl BCl (2.5mm) </td><td> 2μl BCl (0.1mm) </td><td> 2μl BCl (0.5mm) </td><td> 2μl BCl (1 mM) </td><td> 2μl BCl (2mm) </td><td> 2μl BCl (2.5mm) </td><td> 2μl DMSO </td></tr><tr><td> D </td><td> 2μl DMSO </td><td> 2μl BCl (0.1mm) </td><td> 2μl BCl (0.5mm) </td><td> 2μl BCl (1 mM) </td><td> 2μl BCl (2mm) </td><td> 2μl BCl (2.5mm) </td><td> 2μl BCl (0.1mm) </td><td> 2μl BCl (0.5mm) </td><td> 2μl BCl (1 mM) </td><td> 2μl BCl (2mm) </td><td> 2μl BCl (2.5mm) </td><td> 2μl DMSO </td></tr><tr><td> E </td><td> 2μl DMSO </td><td> 2μl BCl (0.1mm) </td><td> 2μl BCl (0.5mm) </td><td> 2μl BCl (1 mM) </td><td> 2μl BCl (2mm) </td><td> 2μl BCl (2.5mm) </td><td> 2μl BCl (0.1mm) </td><td> 2μl BCl (0.5mm) </td><td> 2μl BCl (1 mM) </td><td> 2μl BCl (2mm) </td><td> 2μl BCl (2.5mm) </td><td> 2μl DMSO </td></tr><tr><td> F </td><td> 2μl DMSO </td><td> 2μl BCl (0.1mm) </td><td> 2μl BCl (0.5mm) </td><td> 2μl BCl (1 mM) </td><td> 2μl BCl (2mm) </td><td> 2μl BCl (2.5mm) </td><td> 2μl BCl (0.1mm) </td><td> 2μl BCl (0.5mm) </td><td> 2μl BCl (1 mM) </td><td> 2μl BCl (2mm) </td><td> 2μl BCl (2.5mm) </td><td> 2μl DMSO </td></tr><tr><td> G </td><td> 2μl DMSO </td><td> 2μl BCl (0.1mm) </td><td> 2μl BCl (0.5mm) </td><td> 2μl BCl (1 mM) </td><td> 2μl BCl (2mm) </td><td> 2μl BCl (2.5mm) </td><td> 2μl BCl (0.1mm) </td><td> 2μl BCl (0.5mm) </td><td> 2μl BCl (1 mM) </td><td> 2μl BCl (2mm) </td><td> 2μl BCl (2.5mM) </td><td> 2μl DMSO </td></tr><tr><td> H </td><td> 2μl DMSO </td><td> 2μl BCl (0.1mm) </td><td> 2μl BCl (0.5mm) </td><td> 2μl BCl (1 mM) </td><td> 2μl BCl (2mm) </td><td> 2μl BCl (2.5mm) </td><td> 2μl BCl (0.1mm) </td><td> 2μl BCl (0.5mm) </td><td> 2μl BCl (1 mM) </td><td> 2μl BCl (2mm) </td><td> 2μl BCl (2.5mm) </td><td> 2μl DMSO </td></tr></tbody></table> Les concentrations finales sont 1 uM, 5 um, 10 uM, 20μM, épaisseur 25 BCI dans le DMSO à 1%. Recouvrir la plaque dans du papier aluminium et laisser incuber pendant 6 heures à 28 ° C. </li></ol> 2) l'imagerie automatisée des plaques de 96 puits et d'analyse. <ol><li> Ajouter 10 pi de tricaïne (0,61 mm) à chaque puits pour anesthésier embryons 30hpf. </li><li> Charge plaque dans Molecular appareils ultra Imagexpress. </li><li> Ouvrez le logiciel Metaxpress. Choisissez une configuration avec un objectif 4x et un diamètre maximum de sténopé, configurer laser autofocus pour détecter plaque inférieure, et de déterminer optimale plan Z pour détecter des régions d'intérêt. Acquérir les images au excitation / émission longueurs d'onde de 488/525 nm (GFP). Set zone de numérisation comme un site unique de 2000x2000 pixels (4 x 4 mm), sans binning. Configurer la puissance du laser et le gain de telle sorte que les régions plus brillants dans les images de contrôle positif ne saturent pas. Confirmer l'acquisition d'image correcte dans plusieurs puits de contrôle positif et négatif. </li><li> Démarrer l'analyse assiette. L'instrument sera automatiquement acquérir des images de tous les puits et les archiver dans une base SQL server. </li><li> Upload images en utilisant Definiens Developer le module d'application Cellenger et un filtre d'importation qui reconnaît le format d'image et de la structure des fichiers générés par la plateforme Molecular Devices Imagexpress Ultra. </li><li> Traiter les images avec un algorithme personnalisé destiné Cognition Network Technology (également appelé un jeu de règles). L'algorithme, qui nous personnalisée développée basée sur un ensemble de règles récemment publié 2, est conçu pour identifier automatiquement l'embryon, le jaune, et la tête, et de quantifier la luminosité et le domaine de la GFP exprimant structures de la tête. Les puits dans lesquels aucun embryon n'est détecté ou si la tête ne peut être affecté sans ambiguïté (par exemple, avec une toxicité élevée ou composé d'images floues) sont exclus de l'analyse. Configurer l'algorithme utilisant plusieurs images de contrôle négatif (traités par le véhicule) et des images de contrôle positif (BCI traités) de telle sorte que la tête et le jaune sont correctement identifiés dans les deux. Régler une «tête de structures« seuil de détection comme des multiples d'intensité jaune signifie que la détection des structures de la tête lumineuse correspond à l'observation visuelle. Définir les paramètres d'exportation. Dans cet exemple, le paramètre le plus informatif a été la luminosité intégrée totale de la GFP-positives dans la tête des régions ci-après appelé «tête de luminosité totale des structures» (figure 1). <img src="/files/ftp_upload/1900/1900fig2.jpg" alt="Figure 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1"> Figure 1 Graphique depicitng les effets dose-dépendante de la BCI sur l'expression de GFP dans les embryons transgéniques. </li><li> Exécuter l'algorithme sur toutes les images plaque à l'aide du planificateur intégré d'emplois. Le logiciel Definiens utilise l'informatique distribuée sur plusieurs processeurs («moteurs»), permettant l'analyse simultanée de plusieurs images. L'algorithme calcule les mesures numériques basés sur les résultats de l'analyse d'image, qui sont enregistrées dans la base de données avec une copie de l'image traitée, avec l'analyse appliquée. </li></ol> Les résultats représentatifs: Après toutes les images sont analysées, les données peuvent être visualisées au sein Cellenger ou exportées vers un logiciel tiers (Excel, GraphPad Prism) pour une analyse approfondie et de représentation graphique. La figure 2 montre les images archivées numériser à partir d'un véhicule et un traité BCI-bien traités, avec et sans CNT analyse appliquée. Figure 1 documents un effet dose-dépendant de la BCI sur l'expression du gène rapporteur GFP dans les Tg (dusp6: d2EGFP) PT6 embryons. La concentration nécessaire pour obtenir une réponse maximale moitié (50) était d'environ 12 um. <img src="/files/ftp_upload/1900/1900fig1.jpg" alt="Figure 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 2"> Figure 2 Capture d'image automatisée et l'analyse des embryons de poissons zèbres transgéniques. (A) du véhicule DMSO traitée Tg (dusp6: d2eGFP) PT6 embryon au 30hpf. (B) des embryons transgéniques traitées avec 20μM BCI montrent des augmentations dans l'expression de la GFP. (C) image de l'embryon à partir de (A) après l'exécution de Definiens ruleset de trouver expression de la GFP dans la tête. Taches orange indiquent où le logiciel mesure l'intensité de la GFP. (D) image de l'embryon à partir de (B) après l'exécution de Definiens ruleset de trouver expression de la GFP dans la tête. Taches orange indiquent où le logiciel mesure l'intensité de la GFP. Notez que le jeu de règles a été en mesure de trouver un espace élargi de l'expression de GFP dans les embryons traités.

<ol><li>Molina, G. A., Watkins, S. C., Tsang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+FGF+reporter+transgenic+zebrafish+and+their+utility+in+chemical+screens%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Generation of FGF reporter transgenic zebrafish and their utility in chemical screens.</a> BMC Dev Biol. 7, 62-62 (2007).</li>
<li>Vogt, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+image-based+phenotypic+analysis+in+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Automated image-based phenotypic analysis in zebrafish embryos.</a> Dev Dyn. 238, 656-663 (2009).</li>
<li>Molina, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+chemical+screening+reveals+an+inhibitor+of+Dusp6+that+expands+cardiac+cell+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Zebrafish chemical screening reveals an inhibitor of Dusp6 that expands cardiac cell lineages.</a> Nat Chem Biol. 5, 680-687 (2009).</li>
</ol>

Un des principaux facteurs limitant le débit d&#39;écrans chimiques poisson zèbre est l&#39;absence de méthodologie pour traiter systématiquement les plaques 96 puits pour l&#39;imagerie et l&#39;analyse. Parce que les images des organismes multicellulaires complexes, faible contraste, et de nature hétérogène, les algorithmes existants d&#39;analyse d&#39;image ne parviennent pas à détecter et quantifier des structures spécifiques au sein de l&#39;organisme. La plupart des écrans chimiques publiée le poisson-zèbre donc impliquer un examen visuel de chaque puits par un personnel dévoué pendant toute la procédure. Cela empêche généralement la génération de lectures numériques et un archivage complet des images d&#39;écran et les données. Par ailleurs, l&#39;évaluation manuelle élimine plusieurs avantages clés de l&#39;image basée sur le dépistage, à savoir la capacité d&#39;effectuer des analyses rétrospectives de performances de l&#39;écran, pour examiner les changements phénotypiques qui ne sont pas l&#39;objectif principal de la campagne de dépistage (par exemple, la toxicité ou des anomalies du développement) et de traverser référence les données de dépistage avec des écrans passées ou à venir en utilisant la bibliothèque même composé. Dans ce rapport, nous mettons en évidence la méthodologie pour l&#39;imagerie automatisée et d&#39;analyse des embryons de poissons zèbres en plaques multipuits, sans intervention de l&#39;utilisateur. Nous capture d&#39;image automatisée sur un laser ultra ImageXpress confocale à balayage lecteur (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) à l&#39;image de Tg (dusp6: d2EGFP) PT6 embryons en plaques de 96 puits et développé un algorithme d&#39;analyse d&#39;images basée sur la technologie Definiens «Cognition réseau que la GFP quantifiés expression dans les têtes des embryons transgéniques. La méthode livré des réponses classées et quantifié l&#39;activité in vivo d&#39;une petite molécule d&#39;activateur de FGF de signalisation. Des résultats similaires ont été obtenus avec la II épifluorescence basé ArrayScan (Cellomics Inc, Pittsburgh, PA) documentant qu&#39;il est possible de mettre en oeuvre la capture d&#39;image automatisée des embryons de poissons zèbres sur une variété de lecteurs de plaques disponibles dans le commerce 2. Le développement de la méthodologie pour analyser automatiquement les images organisme multicellulaire éliminé le besoin de notation visuelle par un observateur humain et a permis à la génération et l&#39;archivage des données numériques et des images pour l&#39;analyse rétrospective et des comparaisons avec des écrans de demain.

<table><tbody><tr><td>Tricaine (MS222)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Réf. A-5040</td><td></td></tr></tbody></table>

développement de l&#39;imagerie automatisée et d&#39;analyse pour les écrans chimiques du poisson zèbre.

Development of automated imaging and analysis for zebrafish chemical screens. 

Nous démontrons l&#39;application de la base d&#39;images à haute teneur de dépistage (HCS) une méthodologie pour identifier de petites molécules qui peuvent moduler la voie FGF / RAS / MAPK dans des embryons de poissons zèbres. L&#39;embryon de poisson zèbre est un système idéal pour les écrans chimiques in vivo à haute teneur. L&#39;embryon de 1 jour est d&#39;environ vieille 1mm de diamètre et peuvent être facilement rangés dans des boîtes de 96 puits, un format standard pour le criblage haut débit. Durant la première journée de développement, les embryons sont transparents avec la plupart des principaux organes présents, permettant ainsi la visualisation de la formation des tissus durant l&#39;embryogenèse. L&#39;automatisation complète d&#39;écrans chimiques poisson zèbre est toujours un défi, cependant, en particulier dans le développement de l&#39;acquisition automatique d&#39;images et d&#39;analyse. Nous avons déjà généré une ligne journaliste transgénique qui exprime la protéine fluorescente verte (GFP) sous le contrôle de l&#39;activité du FGF et démontré leur utilité dans les écrans chimiques<sup&gt; 1</sup&gt;. Afin d&#39;établir une méthodologie pour les écrans à haut débit organisme tout entier, nous avons développé un système automatisé pour l&#39;imagerie et l&#39;analyse des embryons de poissons zèbres moins 24-48 heures après fécondation (HPF) en plaques de 96 puits<sup&gt; 2</sup&gt;. Dans cette vidéo, nous mettons en évidence les procédures d&#39;rangeant embryons transgéniques en plaques multipuits à 24hpf et l&#39;ajout d&#39;une petite molécule (BCI) qui hyperactivates FGF de signalisation<sup&gt; 3</sup&gt;. Les plaques sont incubées pendant 6 heures, suivie par l&#39;ajout de tricaïne pour anesthésier les larves avant d&#39;imagerie automatisée sur un Molecular Devices ImageXpress Ultra confocale à balayage laser lecteur de HCS. Les images sont traitées par le logiciel Definiens Developer utilisant un algorithme de technologie Cognition réseau que nous avons développé pour détecter et quantifier l&#39;expression de la GFP dans les têtes des embryons transgéniques. Dans cet exemple nous mettons en évidence la capacité de l&#39;algorithme pour mesurer la dose-dépendante des effets de la BCI sur l&#39;expression du gène rapporteur GFP dans les embryons traités.

Nous rapportons le développement d&#39;un système automatisé pour l&#39;imagerie et l&#39;analyse des embryons de poisson zèbre transgénique dans des plaques multipuits. Ceci démontre la capacité de mesurer les effets dose-dépendante d&#39;une petite molécule, la BCI, le Fibroblast Growth Factor expression du gène rapporteur et de fournir la technologie pour établir des écrans à haut débit chimiques du poisson zèbre.

Développement de l&#39;imagerie automatisée et d&#39;analyse pour les écrans chimiques du poisson zèbre.

Nous démontrons l'application de la méthodologie de criblage à haut contenu (HCS) basé sur l'image pour identifier des petites molécules capables de moduler la voie FGF/RAS/MAPK...

Dans cette vidéo, un criblage image fondé sur le contenu est effectué afin d'évaluer la modulation par de petites molécules de la voie de signalisation du facteur de croissance des fibroblastes Rasm map kinase chez des embryons de poisson zèbre. Des poissons zèbres transgéniques mâles et des femelles sauvages sont accouplés dans une cage de reproduction. Les œufs fécondés tombent au fond et sont collectés, puis transférés dans une boîte de Pétri. Les embryons sont incubés toute la nuit, puis placés dans des puits individuels d'une plaque de 96 puits à fond rond.La petite molécule BCI est ajoutée afin d'hyperactiver la signalisation FGF, et la plaque est incubée pendant six heures. Des images de chaque puits sont capturées à l'aide d'un lecteur de plaques confocal et analysées à l'aide d'un algorithme conçu par nos soins, qui fournit les intensités de fluorescence dans des structures embryonnaires spécifiques. Bonjour, je suis Hiba Kado du laboratoire du Dr Michael Chang, du Département de microbiologie et de génétique moléculaire de l'Université de Pittsburgh.Bonjour, je suis Andrea Spock de l'Institut de découverte de médicaments de l'Université de Pittsburgh. Aujourd'hui, nous allons vous montrer la procédure d'élevage, de sélection et de disposition d'embryons de poisson zèbre pour un traitement chimique. Dans une plaque de 96 puits, nous utiliserons des embryons transgéniques qui rendent compte de l'activité du facteur de croissance des fibroblastes et que nous traiterons avec une molécule activant fortement cette voie.Nous allons vous montrer comment nous utilisons la méthodologie de criblage à haut contenu pour acquérir, analyser et quantifier automatiquement l'activité du facteur de croissance des fibroblastes chez des embryons de poisson-zèbre transgéniques. Cette procédure mettra en évidence la technologie de plateforme permettant d'utiliser des poissons-zèbres transgéniques et des criblages chimiques à haut débit. Commençons donc.Deux jours avant le traitement, identifier les poissons-zèbres transgéniques mâles homozygotes et les placer dans des aquariums d'accouplement individuels. Ajouter des séparateurs dans les aquariums, puis introduire une femelle de type sauvage dans chaque aquarium et laisser les poissons en cages d'accouplement toute la nuit à 28 degrés Celsius. Le lendemain matin, retirer le séparateur. Après une heure, transférer les poissons dans un nouvel aquarium et verser les embryons dans une passoire en plastique.Transférez les embryons dans des boîtes de 100 millimètres contenant la solution E3 et incubez-les à 28 degrés Celsius pendant six à huit heures. Après l'incubation, examinez les embryons au microscope stéréo. Les embryons appropriés pour les expériences seront en cours de gastrulation.À ce stade, retirez les embryons non fécondés, qui demeureront au stade de cellule unique. Retirez également les embryons non viables qui apparaissent opaques ou malformés. Ajoutez ensuite une solution E3 fraîche et incubez toute la nuit à 28 degrés Celsius.Le lendemain, placer les embryons sous un microscope stéréo à fluorescence pour trier les embryons transgéniques selon un stade similaire et une expression uniforme de la GFP. À 24 HPF, les embryons présentent une limite visible entre le mésencéphale et le métencéphale, une forte expression de la GFP et des yeux bien formés avec des rétines dorsales GFP-positives. Ces embryons sont actifs et bougent ou gigotent dans leur chorion ; utiliser une pipette Pasteur en plastique.Transférez les embryons de 24 HPF un par un dans des puits individuels d'une plaque de 96 puits. À l'aide d'une micropipette, retirez toute solution E3 en excès des puits. Ensuite, à l'aide d'une pipette multipuits, ajoutez 200 microlitres de solution E3 dans chaque puits.Ensuite, ajoutez deux microlitres de DMSO dans tous les puits des colonnes un et 12. Puis ajoutez deux microlitres de BCL préparé dans du DMSO selon les modalités suivantes : un micromolaire dans les colonnes deux et sept, cinq micromolaires dans les colonnes trois et huit, 10 micromolaires dans les colonnes quatre et neuf, 20 micromolaires.Quelques micromoles dans les colonnes cinq et dix. Et enfin, 25 micromoles dans la colonne six et onze. Recouvrez maintenant la plaque de papier d'aluminium et incubez-la pendant six heures à 28 degrés Celsius.Ajoutez 10 microlitres de trica dans chaque puits pour anesthésier les embryons à 30 HPF. Ensuite, chargez la plaque dans le logiciel molecular devices image express ultra open meta express. Choisissez une configuration avec un objectif Forex et un diamètre de diaphragme maximal.Configurer la mise au point automatique du laser pour détecter le fond de la plaque et utiliser un décalage Z optimal prédéterminé. Pour détecter les régions d'intérêt, définir la zone de balayage comme un seul site de 2000 par 2000 pixels sans bégaiement. Sélectionner le type de plaque approprié ainsi que le laser à argon de 488 nanomètres avec une excitation à 488 nanomètres et une émission à 525 nanomètres.Ensuite, sélectionnez un puits contenant un embryon traité au véhicule et cliquez sur « find sample ». L'appareil effectuera une numérisation de mise au point automatique et acquerra une seule image afin de confirmer une acquisition correcte. Choisissez aléatoirement un puits traité au véhicule et acquérez une image.Si l'image est nette et montre une expression de la GFP dans la tête. Placez le curseur sur les zones les plus brillantes et vérifiez que l'intensité de fluorescence se situe dans la plage d'un capteur 16 bits. Inférieure à 65 000 unités.Répétez ces étapes avec un autre puits contrôle véhicule et quelques puits traités au composé. Si nécessaire, ajustez la puissance du laser et le gain de manière à ce que les régions les plus brillantes des images du contrôle positif ne soient pas saturées. Ensuite, dans la fenêtre d'acquisition de la plaque et de contrôle, sélectionnez acquérir la plaque pour démarrer l'analyse de la plaque.L'instrument acquerra automatiquement une image par puits pour toute la microplaque et les archivera dans une base de données SQL. Une fois le balayage terminé, téléversez les images dans D definition's Developer en ouvrant Developer avec l'option slinger activée.Créez un nouvel espace de travail. Ensuite, dans le menu fichier, sélectionnez l'importation personnalisée. Puis, accédez au dossier contenant les images et ouvrez un fichier exemple.Choisissez un filtre d'importation qui reconnaît le format d'image et la structure de fichier générés par la plateforme d'appareils moléculaires ImageXpress Ultra. Pour traiter les images, ouvrez maintenant une image témoin et chargez la technologie de réseau cognitif souhaitée, ou algorithme CNT, ou jeu de règles. L'algorithme personnalisé utilisé ici est conçu pour identifier automatiquement l'embryon, le vitellus et la tête, et pour quantifier la luminosité et la surface des structures de la tête exprimant la GFP ; exécutez le jeu de règles jusqu'à l'étape de détection de la tête et du vitellus.Pour garantir une attribution correcte du sac vitellin et de la tête, modifiez l'ensemble de règles afin d'ajuster le seuil de détection du vitellus si celui-ci est trop grand ou trop petit. Ensuite, exécutez l'ensemble de règles jusqu'à l'étape de détection des structures brillantes de la tête. Pour assurer une attribution correcte des régions exprimant la GFP dans la tête, modifiez l'ensemble de règles afin d'ajuster le seuil de détection des structures de la tête en multiples de l'intensité moyenne, jusqu'à ce que la détection des structures brillantes de la tête corresponde à l'observation visuelle.Ensuite, exécutez manuellement l'ensemble complet des règles sur plusieurs images choisies aléatoirement, générées à partir d'embryons traités au véhicule, ainsi que sur des images de contrôle positif provenant d'embryons traités au PCI. Pour exécuter l'algorithme sur toutes les images des plaques, sélectionnez les plaques à analyser, puis choisissez Analyser. Ensuite, accédez à l'ensemble de règles optimisé et analysez tous les puits.À l'aide du planificateur de tâches intégré, les puits vides ou les images ambigües sont automatiquement exclus de l'analyse pendant le balayage. Une carte de conservation en continu est affichée. Les données et les images sont accessibles pendant l'exécution pour inspection visuelle.Les données numériques et les images traitées sont automatiquement enregistrées. Une fois que toutes les images ont été analysées, les données peuvent être exportées vers des logiciels tiers tels qu'Excel, GraphPad ou Prism. Cette figure montre des images de scan archivées provenant d'un puits traité au véhicule et d'un puits traité à un BCI, avec et sans analyse CNT.La protéine fluorescente verte, ou GFP, appliquée est détectée dans l’œil, à la limite entre le mésencéphale et le métencéphale, ainsi que dans les ganglions trijumeaux d’embryons transgéniques. Remarquez que l’intensité de la GFP et les domaines d’expression sont tous deux élargis. Chez les embryons traités au BCI présentés ici, on observe un effet dose-dépendant du BCI sur l’expression du gène rapporteur GFP dans les embryons transgéniques.La concentration nécessaire pour obtenir une réponse demi-maximale ou EC 50 était d'environ 12 micromolaire. Nous venons de vous montrer comment élever, collecter et disposer des embryons de poisson-zèbre transgéniques dans des plaques de 96 puits. Nous avons ajouté des concentrations croissantes de PCI à l'activateur du chemin de signalisation.Nous avons également montré comment automatiser l'acquisition d'images d'embryons transgéniques et avons analysé ces images à l'aide d'un algorithme sur mesure fondé sur la technologie de réseau cognitif. Grâce à cette approche, nous avons pu mesurer de manière quantitative et progressive les effets d'un activateur, sous forme de petite molécule, de la voie de signalisation du facteur de croissance des fibroblastes. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de bien choisir les embryons afin de minimiser la variabilité entre les échantillons.C'est tout. Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.

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Décrit ici est un protocole d'imagerie semi-automatisé de la fluorescence spécifique de tissu d'embryons de poisson zèbre.

Imagerie semi-automatique de la fluorescence spécifique de tissu dans embryons de poissons zèbres

Le poisson zèbre est un excellent organisme expérimental pour étudier les processus de développement de vertébrés et modèle des maladies humaines. Ici, nous décrivons un protocole sur la façon d'effectuer un écran chimique à haut débit manuel embryons de poisson zèbre avec un ensemble de montage hybridation in situ (WISH) lecture.

Un petit écran Molecule Manuel approchant à haut débit utilisant embryons de poissons zèbres

Nous présentons ici un protocole visant à concevoir et fabriquer un embryon de poisson zèbre parant modèle, suivie d’une procédure détaillée sur l’utilisation de ce modèle pour haut débit embryon de poisson zèbre parant dans une plaque de 96 puits.

3 Dimensions (3D)-imprimé le modèle pour l’embryon de poisson zèbre haut débit parant

Les embryons de poissons zèbres sont utilisés pour évaluer la toxicité des composés chimiques. Ils se développent à l'extérieur et sont sensibles aux produits chimiques, permettant la détection de changements phénotypiques subtils. L'expérience ne nécessite qu'une petite quantité de composé, qui est directement ajouté à la plaque contenant des embryons, ce qui rend le système de test efficace et rentable.

Évaluation rapide de la toxicité des composés chimiques à l'aide d'embryons de poisson zèbre

Les modèles de xénogreffe de poisson zèbre permettent le dépistage des médicaments à haut débit et l’imagerie fluorescente des cellules cancéreuses humaines dans un microenvironnement in vivo. Nous avons mis au point un flux de travail pour le dépistage automatisé à grande échelle des médicaments sur des échantillons de leucémie dérivés du patient chez le poisson zèbre à l’aide d’une unité d’imagerie automatisée équipée d’un microscope à fluorescence.

Dépistage de drogue des xénogreffes dérivées de tumeur de patient primaire dans le poisson-zèbre

Nous décrivons le flux de travail et l’analyse des données d’un système de criblage pour évaluer la toxicité des composés chimiques en fonction de la réponse au sursaut par vibration de l’embryon de poisson-zèbre. Le système enregistre les mouvements des embryons de poisson-zèbre lorsqu’ils sont exposés à un stimulus vibratoire et permet une évaluation intégrée de la toxicité/létalité générale et de la toxicité neuromusculaire.

Évaluation de la toxicité des produits chimiques à l’aide d’un système de criblage de réaction au sursaut par vibration du poisson-zèbre

Découvrez l'imagerie automatisée pour les cribles chimiques chez Danio rerio. Cette méthode quantifie les effets dose-dépendants des petites molécules sur la signalisation FGF en utilisant un lecteur confocal et un algorithme personnalisé.

Développement de l'imagerie automatisée et d'analyse pour les écrans chimiques du poisson zèbre.

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