Aide d'un compteur de cellules automatisé pour simplifier les études d'expression génique: Knockdown siRNA de l'IL-4 dans l'expression des gènes dépendant cellules Namalwa

L'objectif général de cette procédure est d'utiliser l'électroporation pour introduire des ARNsi dans des cellules difficiles à transfecter afin d'étudier l'expression génique. Cela est réalisé en déterminant d'abord la quantité de suspension cellulaire nécessaire à l'aide du compteur de cellules automatisé TC 10. L'ARNi est ensuite ajouté à la suspension cellulaire et les cellules sont électroporées.

À l'aide du système d'électroporation MXL, les cellules sont incubées pendant 24 heures après l'électroporation. Ensuite, l'IL-4 est ajouté pour induire la transcription génique dans les cellules expérimentales. Enfin, l'ARN est extrait et une PCR en temps réel est utilisée pour mesurer les niveaux d'expression génique.

En fin de compte, on peut obtenir des résultats montrant l'effet de siARN spécifiques sur les voies d'expression génique. Bonjour, je suis Adam McCoy, scientifique principal au sein de la division d'expression génique de Bio Rad Laboratories. Aujourd'hui, nous allons vous montrer la procédure permettant d'introduire des ARN dans des lignées cellulaires difficiles à transfecter par électroporation, puis d'examiner les effets sur l'expression génique.

Nous utilisons cette procédure dans notre laboratoire pour analyser l'expression génique de gènes individuels ou étudier les voies géniques en inactivant un gène et en recherchant les effets en aval. Commençons donc. En travaillant sous une hotte de culture cellulaire, retirez les cellules d'un flacon de culture.

Les cellules utilisées dans ce protocole sont des cellules en suspension. Si vous utilisez des cellules adhérentes, vous devrez les détacher à l’aide de trypsine avant de les prélever. Centrifuger les cellules pour former un culot.

Après avoir centrifugé les cellules, retirez le surnageant et resuspendez les cellules dans du PBS. Pour déterminer le nombre de cellules vivantes, prélevez un aliquot de la suspension cellulaire et ajoutez le colorant au bleu de trypan selon un rapport de un pour un afin de colorer les cellules mortes. Le bleu de trypan est nécessaire pour l'évaluation des cellules vivantes et mortes, mais pas pour le décompte total des cellules.

Appliquez uniquement le mélange sur l'ouverture d'une lame de comptage jetable et insérez-la dans le compteur cellulaire automatisé TC 10. Le TC 10 effectue d'abord une mise au point automatique afin d'assurer un décompte aussi précis que possible, puis commence à compter les cellules. Le nombre de cellules vivantes et le nombre total de cellules par millilitre dans l'échantillon sont affichés.

Sélectionnez l'icône « afficher l'image » pour afficher les cellules sur l'écran de visualisation. Ensuite, à l'aide des flèches haut ou bas, zoomez avant ou arrière selon les besoins pour calculer la quantité de suspension cellulaire nécessaire aux expériences, puis sélectionnez la calculatrice de dilution.

Saisissez la concentration souhaitée et les valeurs de volume final pour cette expérience. Un total de 16 échantillons sera préparé, incluant des doublons pour chaque traitement. Ainsi, un volume total de 3,6 millilitres d'une suspension à cinq fois 10 puissance six cellules par millilitre sera nécessaire.

Le compteur de cellules indiquera alors le volume de suspension cellulaire nécessaire en fonction du nombre de cellules viables et des valeurs cibles saisies. Si le bleu TRIAM a été utilisé, le compteur ajustera automatiquement la dilution au rapport un pour un. Maintenant, sous une hotte, transférez le volume calculé de suspension cellulaire dans un nouveau tube.

Ensuite, centrifuger les mélanges cellulaires pour former un culot cellulaire pendant que les cellules sédimentent. Préparer des tubes microfuge pour l'électroporation en ajoutant du SIR A à chaque tube. Pour cette expérience, un contrôle irna, deux stat six siARN spécifiques et des contrôles non traités seront préparés. Après la centrifugation, éliminer le PBS et resuspendre les cellules dans 3,6 millilitres de tampon d'électroporation Gene Pulser, puis transférer des aliquots de 800 microlitres dans les tubes contenant l'irna approprié et mélanger délicatement.

Les cellules sont désormais prêtes pour l'électroporation afin de traiter tous les échantillons simultanément. À l'aide du système d'électroporation MXL, transférez 150 microlitres de chaque suspension cellulaire dans les puits appropriés d'une plaque d'électroporation à 96 puits. Ensuite, placez la plaque dans la chambre de la plaque du système d'électroporation MXL et fermez le couvercle.

Sélectionnez le protocole d'électroporation souhaité et appuyez sur impulsion pour traiter les cellules. Une fois l'électroporation terminée, retirez la plaque de l'appareil et transférez les cellules dans une nouvelle plaque de culture contenant du milieu préchauffé. Ensuite, transférez 150 microlitres de cellules témoins non traitées pour chaque échantillon dans la nouvelle boîte. Puis placez les cellules à 37 degrés Celsius, 5 % de dioxyde de carbone, pendant la nuit.

Après 24 heures, utiliser l'IL-4 pour induire la transcription génique dans un premier ensemble de cellules et ajouter uniquement du milieu au second ensemble. Une quantité d'IL-4 est ajoutée aux cellules. Poursuivre l'incubation pendant 24 heures supplémentaires à 37 °C et 5 % de dioxyde de carbone, après un temps total de croissance de 48 heures.

Il peut y avoir de grandes différences de densité cellulaire si le traitement expérimental affecte la division cellulaire. Il est donc conseillé d'utiliser le compteur cellulaire automatisé TC 10 pour recompter rapidement les cellules en fonction des dénombrements cellulaires. Transférez un aliquot de chaque puits dans un tube microfuge pour l'extraction d'ARN et congélez-le.

Un deuxième aliquot pour le western blot ou toute autre analyse protéique. Aujourd'hui, seul le protocole d'ARN sera présenté. Centrifuger les échantillons pour former un culot cellulaire.

Ensuite, retirez et jetez le SUP natin de chaque tube. Poursuivez l'extraction de l'ARN en utilisant le kit d'ARN total orum. Une fois l'ARN extrait, procédez immédiatement à l'analyse en maintenant les échantillons sur de la glace.

Pour vérifier en une seule étape la qualité et la quantité d'ARN, utilisez la station d'électrophorèse automatisée Experian afin de dénaturer les échantillons par chaleur et l'ADN marteau Experian, puis placez-les sur de la glace. Ajoutez un mélange préparé de gel et de colorant au puits de amorçage sur une puce à ARN, puis réglez le code d'amorçage sur la station d'amorçage.

Placer la puce dans la station de amorçage automatisée et appuyer sur démarrer. Retirer la puce de la station d'amorçage et charger la puce. Vortexer la puce pour mélanger les échantillons avec le tampon de charge.

Placez la puce dans la station d'électrophorèse et démarrez la course. Le logiciel Experian affichera automatiquement les résultats sous forme d'un électrophérogramme, d'un tableau de résultats indiquant la concentration en ARN, le rapport ribosomal et le nombre indicateur de qualité de l'ARN, ainsi que d'un gel virtuel, similaire à un gel d'ARN traditionnel. Les échantillons d'ARN total de haute qualité présentent généralement un IQR compris entre 8 et 10.

Après avoir vérifié la qualité de l'ARN, préparez ici les réactions d'ADNc. Le mélange IS script ONEstep R-T-P-C-R est utilisé pour combiner la synthèse d'ADNc et la PCR en temps réel. Dans une réaction, préparez un mélange maître contenant tous les composants de la réaction sauf les gabits d'ARN pour chaque jeu d'amorces.

Ensuite, répartir le mélange dans les puits d'une plaque PCR. Après avoir dilué l'ARN à une concentration uniforme, ajouter les échantillons dans les puits appropriés en triplets. Sceller la plaque, la placer dans l'appareil de PCR en temps réel, puis sélectionner le protocole approprié et démarrer l'analyse. Une fois l'analyse terminée, utiliser les tracés en temps réel pour déterminer les niveaux d'expression.

Le logiciel calcule l'expression génique normalisée à partir des données, en se basant sur l'expression relative des gènes expérimentaux et de référence dans les cellules traitées et les cellules contrôles. Cette figure présente un aperçu de la voie de signalisation de l'IL-4, où la liaison de l'IL-4 à son récepteur entraîne la dimérisation et l'activation de STAT6 ; STAT6 activé transloque vers le noyau et active la transcription de ses gènes cibles.

Des gènes tels que CCL 17 sans induction par l'IL-4, la transcription de CCL 17 restera à des niveaux constitutifs faibles après la suppression médiée par ARNi du gène STAT6. Le traitement par l'IL-4 devrait entraîner une augmentation faible ou nulle de l'expression de CCL 17. L'induction de CCL 17 par l'IL-4 a été mesurée dans différentes conditions par PCR quantitative en temps réel.

Les échantillons PCR cultivés sans IL-4 présentaient un faible niveau constitutif d'expression. Indépendamment du sir, A fourni comme indiqué dans les échantillons témoins vert et bleu a répondu normalement au traitement par l'IL-4, avec une induction de 8 à 10 fois du CCL17. Toutefois, les cellules transfectées avec des siARN ciblant STAT6, indiquées en rouge et rose, présentaient une expression réduite du CCL17 en réponse à l'IL-4, ce qui soutient l'idée que STAT6 joue un rôle dans l'expression induite par l'IL-4 du CCL17.

Nous venons de vous montrer comment introduire des siARN por dans une lignée cellulaire en suspension difficile à transfecter et comment suivre l'expression d'un gène dans ces cellules. Lorsque vous effectuez cette procédure, il est important de garder à l'esprit de maintenir les conditions aussi constantes que possible pour tous les échantillons. Voilà donc tout.

Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.