Aide d'un compteur de cellules automatisé pour simplifier les études d'expression génique: Knockdown siRNA de l'IL-4 dans l'expression des gènes dépendant cellules Namalwa

L’objectif global de cette procédure est d’utiliser l’électroporation pour introduire des siRNA dans des cellules difficiles à transfecter afin d’étudier l’expression des gènes. Pour ce faire, il suffit d’abord de déterminer la quantité de suspension de cellule awa nécessaire à l’aide du TC 10. Un compteur de cellules automatisé irna est ensuite ajouté à la suspension cellulaire et les cellules sont électro-créées.

À l’aide du système d’électroporation MXL, les cellules sont incubées pendant 24 heures après l’électroporation. Ensuite, IL quatre est ajouté pour induire la transcription des gènes dans les cellules expérimentales. Enfin, l’ARN est extrait et la PCR en temps réel est utilisée pour mesurer les niveaux d’expression des gènes.

En fin de compte, on peut obtenir des résultats qui montrent l’effet de siRNA spécifiques sur les voies d’expression des gènes. Bonjour, je m’appelle Adam McCoy, je suis scientifique principal pour la division expression génique de Bio Rad Laboratories. Aujourd’hui, nous allons vous montrer la procédure d’introduction d’ARN dans des lignées cellulaires difficiles à transfecter par électroporation, puis examiner les effets sur l’expression des gènes.

Nous utilisons cette procédure dans notre laboratoire pour analyser l’expression génique de gènes uniques ou étudier les voies génétiques en éliminant un gène et en recherchant des effets en aval. Alors commençons. En travaillant sous une hotte de culture cellulaire, retirez les cellules d’un ballon de culture.

Les cellules utilisées dans ce protocole sont des cellules en suspension. Si vous utilisez des cellules adhérentes, vous devrez essayer de trypsine dans les yeux avant de les retirer. Centrifugez les cellules pour les granuler.

Une fois que les cellules ont été essorées, retirez le surnageant et remettez les cellules en suspension dans le PBS. Pour déterminer le nombre de cellules vivantes, prélevez une aliquote de la suspension cellulaire et ajoutez une coloration au bleu trian dans un rapport de un pour un pour colorer les cellules mortes. Le bleu Trian est requis pour l’évaluation des cellules mortes vivantes, mais pas pour le nombre total de cellules.

Il suffit de déposer le mélange sur l’ouverture d’une lame de comptage jetable et de l’insérer dans le compteur de cellules automatisé TC 10. Le TC 10 fera d’abord la mise au point automatique pour assurer le comptage le plus précis, puis nous commencerons à compter les cellules. Le nombre de cellules vivantes et totales par millilitre dans l’échantillon est affiché.

Sélectionnez Afficher l’image pour afficher les cellules sur l’écran d’affichage. Puis à l’aide des flèches vers le haut ou vers le bas. Effectuez un zoom avant ou arrière si nécessaire pour calculer la quantité de suspension cellulaire nécessaire aux expériences, sélectionnez le calculateur de dilution.

Entrez la concentration souhaitée et les valeurs de volume final pour cette expérience. Au total, 16 échantillons seront préparés, y compris les duplicatas pour chaque traitement. Ainsi, un total de 3,6 millilitres d’une suspension de cinq fois 10 des six cellules par millilitre sera nécessaire.

Le compteur de cellules indiquera alors le volume de suspension cellulaire nécessaire en fonction du nombre de cellules vivantes et des valeurs cibles saisies. Si TRIAM blue a été utilisé, le compteur s’ajustera automatiquement à la dilution un à un utilisée. Maintenant, sous un capot, transférez le volume calculé de suspension cellulaire dans un nouveau tube.

Ensuite, faites tourner les mélanges de cellules pour granuler les cellules pendant que les cellules tournent vers le bas. Préparez les micro-tubes pour l’électroporation en ajoutant SIR A à chaque tube. Pour cette expérience, un contrôle de l’ARNi deux stat six siRNA spécifiques et des contrôles non réséqués seront préparés Après la centrifugation, retirer le PBS et remettre les cellules en suspension dans 3,6 millilitres de gène Tampon d’électroporation par impulsion transférer 800 microlitres d’aliquotes dans des tubes contenant l’ARNA approprié et mélanger doucement.

Les cellules sont maintenant prêtes pour l’électroporation afin de manger tous les échantillons simultanément. À l’aide du système d’électroporation MXL, transférez 150 microlitres de chaque suspension de cellule dans les puits appropriés d’une plaque d’électroporation de 96 puits. Ensuite, placez la plaque dans la chambre à plaques du système d’électroporation MXL et fermez le couvercle.

Sélectionnez le protocole d’électroporation souhaité et appuyez sur l’impulsion pour manger les cellules une fois l’électroporation terminée, retirez la plaque de l’instrument et transférez les cellules sur une nouvelle plaque de culture tissulaire contenant du préchauffage au milieu. Ensuite, transférez 150 microlitres de cellules de contrôle non classées pour chaque échantillon dans la nouvelle boîte. Placez ensuite les cellules à 37 degrés Celsius, 5 % de dioxyde de carbone pendant la nuit.

Après 24 heures, utilisez IL quatre pour induire la transcription génique dans un ensemble de cellules et ajoutez du milieu uniquement au deuxième ensemble. Un IL quatre est ajouté aux cellules. Incuber 24 heures supplémentaires à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone après un total de 48 heures de croissance.

Il peut y avoir de grandes différences dans la densité cellulaire si le traitement expérimental affecte la division cellulaire. C’est donc une bonne idée d’utiliser le compteur de cellules automatisé TC 10 pour compter rapidement les cellules en fonction du nombre de cellules. Transférez une aliquote de chaque puits dans un tube de micro-fuge pour l’extraction de l’ARN et la congélation.

Une deuxième aliquote pour le western blot ou l’analyse d’autres protéines. Aujourd’hui, seul le flux de travail de l’ARN sera affiché. Centrifuger les échantillons pour granuler les cellules.

Retirez et jetez ensuite le SUP natin de chaque tube. Procédez à l’extraction de l’ARN à l’aide du kit d’ARN total onum. Une fois l’ARN extrait, procédez immédiatement à l’analyse, en gardant les échantillons sur de la glace.

Pour vérifier la qualité et la quantité d’ARN en une seule étape, utilisez la station d’électrophorèse automatisée Experian pour dénaturer les échantillons et l’échelle d’ARN Experian et placez-les sur de la glace. Ajoutez un mélange préparé de gel et de teinture à l’apprêt. Eh bien, sur une puce à ARN, réglez le code d’amorçage sur la station d’amorçage.

Placez la puce dans la station d’amorçage automatisée et appuyez sur Start. Retirez la puce de la station d’amorçage et chargez la puce. Vortex la puce pour mélanger les échantillons avec le tampon de chargement.

Placez la puce dans la station d’électrophorèse et commencez la course. Le logiciel Experian affichera automatiquement les résultats sous la forme d’un électrophérogramme, d’un tableau de résultats qui affiche la concentration d’ARN, le rapport ribosomique, le numéro de l’indicateur de qualité de l’ARN et d’un gel virtuel, qui ressemble à un gel d’ARN traditionnel. Les échantillons d’ARN total de haute qualité auront généralement un RQI de huit à 10.

Après avoir vérifié la qualité de l’ARN, préparez les réactions CD NA ici. Le mélange IS script ONEstep R-T-P-C-R est utilisé pour combiner la synthèse CD NA et la PCR en temps réel. En une seule réaction, faites un mélange maître contenant tous les composants de la réaction, à l’exception des matrices d’ARN pour chaque ensemble d’amorces.

Répartissez ensuite le mélange dans les puits d’une plaque PCR. Après avoir dilué l’ARN à une concentration uniforme, ajoutez les échantillons dans les puits appropriés et tripliquez. Scellez la plaque, placez-la dans la machine de PCR en temps réel, puis sélectionnez le protocole approprié et commencez l’exécution une fois l’exécution terminée, utilisez les traces en temps réel pour déterminer les niveaux d’expression.

Le logiciel calcule l’expression génique normalisée à partir des données sur la base de l’expression relative des gènes expérimentaux et de référence dans les cellules traitées et contrôlées. Cette figure montre une vue d’ensemble de la liaison de la voie de signalisation IL quatre d’IL quatre à son récepteur. Conduit à la diarisation et à l’activation de STAT six, STAT six activé se déplace vers le noyau et active la transcription de sa cible.

Des gènes tels que CCL 17 sans transcription d’induction IL quatre de CCL 17 resteront à de faibles niveaux constitutifs après l’inactivation du gène STAT six médiée par l’ARN. Le traitement par IL 4 devrait entraîner une augmentation faible ou nulle de l’expression de CCL 17. L’induction de CCL 17 par IL quatre a été mesurée dans différentes conditions par temps réel quantitatif.

échantillons PCR cultivés sans IL quatre avaient un faible niveau d’expression constitutif. Quel que soit le monsieur, A délivré comme indiqué dans les échantillons de contrôle verts et bleus a répondu normalement au traitement par IL quatre avec une induction de huit à dix fois de CCL 17. Cependant, les cellules transfectées avec des siRNA ciblant STAT six, montrés en rouge et en rose, présentaient une diminution de l’expression de CCL L 17 en réponse à IL 4, soutenant l’idée que STAT six joue un rôle dans l’expression de CCL 17 induite par IL FOUR.

Nous venons de vous montrer comment transformer des siARN en une lignée cellulaire en suspension difficile à transfecter et comment suivre l’expression d’un gène dans ces cellules. Lors de cette procédure, il est important de ne pas oublier de garder les choses aussi cohérentes que possible sur tous les échantillons. Donc c’est tout.

Merci d’avoir regardé et bonne chance dans vos expériences.