L'analyse des complexes protéiques par spectrométrie de masse Grande structurels

L’objectif général de l’expérience suivante est de caractériser de grands assemblages de protéines à l’aide de la spectrométrie de masse structurale. Ceci est réalisé en préparant des capillaires plaqués or pour l’ionisation par électro-pulvérisation à nano-flux. Dans un deuxième temps, l’échantillon est préparé et le spectromètre de masse est étalonné pour des mesures de masse élevée.

Ensuite, les conditions expérimentales sont optimisées afin de maintenir les complexes protéiques intacts en phase gazeuse. Le MS et le tandem Ms.Spectra sont ensuite acquis. Les expériences MS Spectra ont montré des états de charge correspondant en masse au complexe intact, tandis que les expériences MS en tandem ont produit des motifs d’association de monomères et de complexes dépouillés.

Bonjour, je m’appelle Naam Kiba du laboratoire de Miron à l’Institut Whiteman des sciences, et je m’appelle Isaac Ky.Je suis aussi du laboratoire de michelon. Aujourd’hui, nous aimerions vous montrer la procédure de base pour analyser les grands complexes protéiques en appliquant la spectrométrie structurale, et nous utilisons cette procédure dans notre laboratoire pour caractériser les complexes protéiques afin de définir la géométrie de votre stock, votre composition et vos réseaux d’interaction. Alors commençons.

L’analyse des complexes protéiques liés non actuels est effectuée par la technique d’immunisation par pulvérisation d’air en utilisant des capillaires comme emme plus ou a qua. Ce C capillaire peut être tiré à une pointe fine d’environ un micron de diamètre, puis recouvert d’un matériau conducteur comme l’or. Ces capillaires sont disponibles dans le commerce, comme vous pouvez le voir ici.

Cependant, il est beaucoup plus rentable à utiliser. Les capillaires en verre, eh, qui peuvent être alors refroidis et recouverts à l’état de refroidissement prêt à l’emploi, sont effectués sur ce dispositif de mise en pool d’aiguilles et de revêtement sur ce dispositif de revêtement eh. Pour commencer cette procédure, fixez deux bandes d’un tampon adhésif double face au fond d’une boîte de Pétri, en gardant les bandes à deux centimètres de distance.

Placez une tige de verre au centre de l’un des tampons. Le tampon adhésif maintient les capillaires en place et la tige de verre soutient les capillaires préparés et empêche les pointes des capillaires de se casser. Capillaires en verre silicaté Boris d’occasion d’un diamètre extérieur d’un millimètre et d’un diamètre de 0,78 millimètre.

Insérez un capillaire dans l’aiguille, agglomérez doucement le capillaire en place et ajustez sa position de manière à ce qu’il se trouve au centre du filament chauffant. Serrez doucement les pinces jusqu’à ce que les capillaires restent fermes aux deux extrémités. Tirez le capillaire à l’aide du programme prédéfini illustré ici.

Cependant, n’oubliez pas que le processus de programmation de l’extracteur est un processus d’essais et d’erreurs. Jusqu’à ce qu’une forme de pointe acceptable soit obtenue, chaque capillaire tiré donne naissance à deux capillaires de forme finale. Retirez les capillaires tirés de l’instrument et inspectez les pointes, en jetant celles qui sont déformées ou cassées.

À l’aide d’une pince à épiler de positionnement émoussée, placez les capillaires dans la boîte de Pétri. La base des capillaires fixée au tampon adhésif et la partie supérieure s’appuie sur la tige de verre avec une pointe pointant vers le haut. Continuez à tirer les capillaires jusqu’à ce que la boîte de Pétri soit pleine.

Environ 80 capillaires tiennent dans une boîte de 10 centimètres de diamètre. Ensuite, enduisez les capillaires d’or. Insérez la plaque dans le bac à cathodes doré.

Assurez-vous que l’alimentation en gaz est choisie conformément aux instructions du fabricant et activez un cycle de revêtement prédéfini. Le revêtement est répété trois à six fois jusqu’à ce que les capillaires soient uniformément dorés. Une fois les capillaires prêts, procédez à l’étalonnage du spectromètre de masse.

La plupart des expériences menées sur les complexes MultiPro sont réalisées par un spectromètre de masse à quadruple temps de vol al Electrospray comme celui-ci. Inuption des eaux, qui est modifiée pour les grandes masses. Avant de charger l’échantillon de protéines, calibrez le spectromètre de masse à l’aide d’iodure de césium.

Tout d’abord, préparez une solution de césium de 100 milligrammes par millilitre dans de l’eau purifiée, le césium est utilisé pour l’étalonnage de masse élevée. Comme les grappes de sel chargées individuellement s’étendent sur une large gamme de masse allant de 393 mât à rapport de charge à bien plus de 10 000. À l’aide d’une pince à épiler émoussée, prélevez un capillaire enduit de la boîte de Pétri et chargez deux microlitres de la solution de césium dans le capillaire.

À l’aide d’un embout chargé de gel einor. Faites glisser la solution vers l’extrémité du capillaire, soit manuellement, soit à l’aide d’un adaptateur de vissage. Insérez le capillaire dans le support capillaire et ajustez le capillaire de manière à ce que l’extrémité soit à environ 10 millimètres du bord du support.

Placez le capillaire sous un microscope optique et utilisez une pince à épiler de type AA bien aiguisée pour couper la pointe. Il est important de vérifier qu’il n’y a pas de bulles d’air à l’intérieur du capillaire qui pourraient bloquer l’écoulement et que le capillaire n’est pas obstrué. De plus, assurez-vous que le revêtement d’or n’est pas dénudé du capillaire.

Si c’est le cas, remplacez le capillaire ou coupez l’embout et retirez la section non revêtue. Ensuite, connectez le support capillaire à l’interface nano flow ESI. Faites pivoter les platines XY, Z vers l’arrière pour éviter d’endommager le capillaire et poussez la platine dans sa position activée.

Le capillaire doit être placé à une distance d’un à 10 millimètres de l’orifice du cône. Appliquez une tension capillaire et une faible pression de nano-débit jusqu’à ce que la pulvérisation soit lancée. Essayez ensuite de réduire la pression d’écoulement nanométrique à une valeur minimale.

Optimisez l’intensité du signal en ajustant l’emplacement de l’étage XYZ, la tension capillaire, la pression d’écoulement nanométrique et le débit de gaz de dissoluvatation. Pour détecter une large gamme de masses de séries de pics saisonniers, les tensions d’accélération doivent être optimisées. Les paramètres utilisés ici sont un cône d’échantillon capillaire de 1,3 à 1,7 kilovolts de 80 à 150 volts, un cône d’extraction, un à trois volts pour optimiser la transmission d’ions de masse élevée, qui nécessitent des conditions de dessalement douces.

La pression de refoulement est portée à cinq à six millibars dans l’étape de vide initiale entre la source et l’analyseur. Pour augmenter la pression d’appui, réduisez soigneusement la conductance de la conduite de vide source vers la pompe à spirale en fermant partiellement la vanne d’isolement tout en surveillant l’effet sur l’intensité du signal. Une fois la configuration des spectromètres de masse terminée, collectez environ 30 balayages à raison d’un balayage par seconde à une plage de rapport de charge principale comprise entre 1000 et 15 000 après l’acquisition, calibrez le temps de vol à l’aide de la table d’étalonnage appropriée.

Maintenant que l’étalonnage est terminé, l’échantillon de protéines peut être chargé. L’échantillon est préparé avant l’étalonnage du spectromètre de masse, de faibles concentrations micromolaires sont nécessaires. Si nécessaire, concentrez l’échantillon à l’aide d’appareils d’ultrafiltration centrifuge.

Vérifiez que le complexe protéique n’est pas absorbé par la membrane du dispositif avant utilisation. En vérifiant le volume et l’absorbance UV, seules des solutions volatiles peuvent être utilisées pour NESI, ce qui rend souvent nécessaire le remplacement du tampon. Une colonne de filtration sur gel de micro-centrifugeuse peut être utilisée pour éliminer toutes les traces de sels, de molécules tampons ou de tout autre adduit non volatil.

Au lieu de cela, suspendez l’échantillon. Une solution aqueuse d’acétate d’ammonium. Cette étape critique détermine la qualité des spectres.

Répétez l’échange de tampon jusqu’à trois fois avec une dilution minimale, inférieure à un facteur de 1,3 par dispositif jusqu’à ce que l’échange maximal soit atteint. Si la concentration et l’échange de tampon sont nécessaires, ceux-ci peuvent être effectués ensemble à l’aide de l’ultrafiltration centrifuge, comme indiqué au début de cette section. Ensuite, chargez l’échantillon comme indiqué pour l’étalonnage de l’iodure de césium et lancez la pulvérisation.

Commencez par une optimisation initiale de la pulvérisation jusqu’à ce que le signal soit détecté. Utilisez l’équation de l’état de charge moyen dans laquelle M est la masse du complexe. Chez Daltons, cependant, la position exacte des états de charge dépend des protéines.

Pour éviter une dissociation complexe, ne chauffez pas la source de fer. Éteignez le chauffage ou maintenez la température en dessous de 40 degrés Celsius. Variez la position du capillaire, les tensions du cône d’échantillon et de l’extracteur.

Pour maximiser la transmission du fer, un point de départ possible est la tension du cône, le cône d’extraction de 100 volts, un volt et la tension capillaire de 1,5 kilovolts. Vérifiez le changement résultant dans les spectres. Optimisez ces paramètres en combinaison avec une pression d’écoulement nano pour améliorer la déification et éliminer l’eau résiduelle et les composants tampons.

Augmentez la tension de polarisation de la pression du gaz dans la cellule de collision. Les tensions de polarisation typiques se situent dans la plage de 10 à 100 volts, avec un débit de gaz de piège de un à 10 millilitres par minute. Effectuez cette opération avec précaution pour éviter l’association du complexe, ajustez le piège et transférez les énergies de collision.

Souvent, des tensions plus élevées, généralement dans la plage de 10 à 30 volts, sont nécessaires pour la transmission d’ions de masse élevée. À ce stade, il est important d’éviter la dissociation du complexe induite par une collision, comme illustré ici. Une fois qu’un signal stable est atteint, il a été recommandé de réduire la pression d’écoulement nanométrique et la tension capillaire à des valeurs minimales tout en maintenant une pulvérisation stable.

Après avoir collecté plusieurs balayages, procédez à l’identification des composants du complexe par spectrométrie de masse en tandem. Une fois qu’un signal optimal et stable a été obtenu pour le complexe protéique, sélectionnez un ion précurseur défini au centre de masse en largeur d’isolement. Généralement, une résolution de masse faible de 12 et une résolution de masse élevée comprise entre 13 et 15 utilisent une large gamme de masse pour détecter les produits de dissociation de masse élevée et de faible charge, puis la réduisent aux valeurs souhaitées pour effectuer ms.

En augmentant l’énergie de collision abrégée CE et la pression sur la cellule de collision, augmentez progressivement le piège ou le transfert CE par paliers de 10 à 20 volts et élevez la pression du gaz de collision à zéro à cinq millilitres par minute. Surveillez les changements dans les spectres jusqu’à ce que les conditions d’activation optimales soient atteintes. Une énergie d’activation élevée peut induire la dissociation d’une ou plusieurs sous-unités du complexe intact et clarifier les affinités d’interaction des différentes sous-unités.

Sélectionnez plus d’une charge pour l’analyse MS ms. Dans le cas de composants qui se chevauchent, l’acquisition d’un ensemble de MS Spectra en tandem aide à résoudre les séries de charges des différentes populations. De plus, les états de charge plus élevés se dissocient plus facilement que les états de charge plus faibles qui superposent la MS et la MS.

Ms pour valider l’isolement de l’ion précurseur choisi. En plus de la caractérisation du complexe intact par MS et ms., MS génère des sous-complexes plus petits et une solution dans des conditions de dénaturation légère et les caractérise également.

L’analyse MS et MS des sous-complexes constituent la base de la définition de l’architecture sous-unitaire du complexe pour la rupture partielle des interactions sous-unitaires : ajouter progressivement des solvants organiques jusqu’à une concentration de 50 % ou modifier le pH de la solution par ajout d’ammoniac ou d’acide formique jusqu’à une concentration de 4 %. Enfin, Pour déterminer les masses des sous-unités individuelles qui composent le complexe, il est important d’acquérir du spectre dans des conditions de dénaturation. Cela peut être réalisé à l’aide de l’embout zip C quatre avec un rapport d’eau-acéto-nitrile de 25 à 75 avec 1 % d’acide formique comme solvant élucique avec toutes les données collectées et analyser les résultats comme détaillé dans le protocole écrit d’accompagnement. Avant de charger l’échantillon du complexe protéique, les spectromètres de masse ont été calibrés à l’aide d’iodure de césium.

La série de pics équidistants marqués en rouge s’étend sur une large gamme allant d’un rapport de charge principal de 393 à bien plus de 10 000. Ils sont chargés individuellement des amas de sel de la composition générale du complexe césium plus. Des signaux supplémentaires entre les pics majeurs marqués en noir sont causés par des espèces à double et triple charge de la série du complexe césium deux plus et du complexe césium plus trois.

L’augmentation de la pression au stade initial du vide est essentielle pour détecter les amas de masse élevée. L’effet de la pression sur les pics de masse élevée est démontré ici avec des lectures de pression de 1,2 et 5,3 millibars. Le spectre de masse pour la pression plus élevée est montré ici élargi.

Voici un exemple de spectrométrie de masse d’un complexe variant de lectine donnant lieu à une distribution d’état de charge comprise entre 3000 et 5 000 rapport de charge maître. Cependant, en raison d’une dessalement adéquate des ions, les pics sont larges. L’augmentation de la tension de polarisation de quatre volts à 15 volts, ce qui entraîne une augmentation des conditions d’accélération, provoque le décapage de l’eau résiduelle et des composants tampons donnant un spectre hautement résolu, la masse mesurée correspond à un complexe pentamère.

L’état de charge plus 15 a ensuite été sélectionné pour l’analyse MS en tandem. L’augmentation de l’énergie de collision provoque la libération d’un monomère fortement chargé centré à un rapport de charge maître de 1 664 et d’un complexe tétramérique dépouillé dans la gamme de 5 000 à 8 000 rapport de charge de masse. Le complexe de variantes de lectines a également été examiné dans des conditions de dénaturation conduisant à une association complexe.

De cette façon, la masse précise des sous-unités individuelles composant le complexe peut être déterminée. Nous venons de vous montrer comment acquérir des spectres MS et Ms en tandem d’ions de haute masse. Lors de cette procédure, il est important de bien préparer votre échantillon et de n’utiliser que des tampons de volatilité compatibles avec la spectrométrie de masse.

Donc c’est tout. Merci d’avoir regardé et bonne chance dans vos expériences.