Name: Quantification des γH2AX Foci en réponse aux radiations ionisantes (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-04-06T19:35:00.000+00:00
Duration: 6 min 53 s
Description: Découvrez la quantification des foci γH2AX par immunofluorescence pour évaluer les cassures double-brin de l'ADN dans des cellules humaines exposées aux radiations ionisantes. Cette méthode permet de surveiller les dommages initiaux et la réparation de l'ADN.

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Le soutien de l&#39;Institut australien des sciences et techniques nucléaires est reconnu. TCK a été récipiendaire du prix AINSE. Laboratoire de médecine épigénomique est soutenu par la National Health and Medical Research Council de l&#39;Australie (566 559). LM est soutenue par la recherche de Melbourne (Université de Melbourne) et biomédicale bourses d&#39;imagerie complémentaires CRC. Le soutien de Monash Micro Imaging (Drs Stephen Cody et Iska Carmichael) a été inestimable pour ce travail.

Préparation des cellules <ol><li> Les kératinocytes humains (FEP-1811) ont été cultivées dans des kératinocytes milieu sans sérum (K-GDF; Invitrogen) supplémenté avec du facteur de croissance épidermique, extrait pituitaire bovin et 20 ug / ml de gentamicine, à 37 ° C et CO 2 5%. </li><li> Une suspension cellulaire unique a été préparé en détachant à la trypsine-EDTA (0,05% v / v) </li><li> Les cellules ont été ensemencées dans 8 puits Lab Tek diapositives microchambre II (10.000 cellules / puits) et les diapositives ont été incubées pendant 3 jours à 37 ° C et 5% de CO 2. </li></ol> L'irradiation <ol><li> Les cellules ont été irradiées sur la glace avec 2 Gy en utilisant une source de 137 Cs (Gammacell 1000 irradiateur Elite; Nordion International, ON, Canada; 20,6 secondes / Gy) </li><li> Le contrôle non irradié et 2 Gy cellules irradiées ont été incubées pendant 1 heure à 37 ° C et 5% de CO 2. </li></ol> Immunofluorescence <ol><li> Media a été averti et les cellules ont été lavées avec 300μl de PBS (w / o Ca 2 + ou Mg 2 +) par puits et ont été tourné sur une table de mixage orbitale pendant 5 minutes. </li><li> Le tampon a été averti et 100 pi d'fraîchement préparés à 4% (v / v) paraformaldéhyde a été ajouté à chaque puits et lames ont été incubées à température ambiante pendant 10 minutes. Toutes les incubations ont été effectuées dans une auge coloration humidifié </li><li> Les cellules ont ensuite été lavées avec du PBS (w / o Ca 2 + ou Mg 2 +). Les lames ont été placées dans une jarre de Coplin et tourné sur un mélangeur orbitale pendant 5 minutes. Cette étape de lavage a été répété encore deux fois. </li><li> Le tampon a été averti et l'excès de PBS a été doucement effacé. </li><li> Les cellules ont été perméabilisées avec 100ml Triton X-100 (0,1% v / v) par puits et une incubation de 10 minutes à température ambiante. </li><li> Les cellules ont été lavées avec du PBS (w / o Ca 2 + ou Mg 2 +) tel que décrit dans les étapes 3 et 4 ci-dessus. </li><li> La liaison aux protéines non spécifique a été bloqué avec 100 ml de BSA (1% v / v) par puits et 20 minutes d'incubation à température ambiante. </li><li> Excès de BSA a été averti et 100 pi d'anticorps monoclonal de souris primaires anti-phospho-histone H2AX anticorps (dilution 1:500, dans 1% de BSA; Millipore), a été ajouté à chaque puits pour une incubation de 1 heure à température ambiante. </li><li> Les cellules ont été lavées avec du PBS (w / o Ca 2 + ou Mg 2 +) tel que décrit dans les étapes 3 et 4 ci-dessus et incubées avec 100 pi d'anticorps secondaire (Alexa Fluor 488 de chèvre anti-IgG de souris dilué 1:500, dans 1% de BSA ; Invitrogen) par puits pendant 45 minutes à température ambiante dans l'obscurité. (Anticorps dilué a été maintenu dans l'obscurité pendant toute la procédure) </li><li> Les cellules ont été lavées avec du PBS (w / o Ca 2 + ou Mg 2 +) tel que décrit dans les étapes 3 et 4 ci-dessus. Toutefois, l'exposition à la lumière a été minimisé en utilisant une feuille. </li><li> Contre-coloration nucléaire a été réalisée avec 100ml Topro3 (dilué 1:500; Invitrogen) par puits et une incubation de 10 minutes à température ambiante </li><li> Les cellules ont été lavées avec du PBS (w / o Ca 2 + ou Mg 2 +) tel que décrit dans l'étape 10 ci-dessus. </li><li> Les chambres ont été soigneusement retiré de la glisse, l'excès d'humidité a été effacé et les diapositives ont été autorisés à l'air sec. </li><li> Une goutte de prolonger OR anti-fade solution (Invitrogen) a été ajouté par puits et lames ont été montées (22x50 mm lamelle) et tout excès de liquide autour des bords de lame a été effacé. </li><li> Les lames ont été maintenus dans l'obscurité pendant 30 minutes à température ambiante avant de sceller avec du vernis à ongles. </li><li> Les lames ont été enregistrées durant la nuit à 4 ° C dans l'obscurité avant l'analyse. </li></ol> Microscopie / Analyse <ol><li> Zeiss LSM510 Meta confocale Microscpe utilisé pour acquérir des images à l'aide de la GFP standard (pour γH2AX - Alexa Fluor 488 de chèvre anti-IgG de souris) et les lasers rouge lointain (pour TOPRO-3). Typiquement, une huile de 63 x objectif d'immersion est utilisé. Les images sont acquises dans un modèle de série Z avec un pas de 0,5 um. Une taille de pas de 0,5 um a été choisi pour minimiser la perte de présenter des foyers dans des plans différents dans les noyaux. Pendant l'analyse, des avions individuels sont déconvolué et empilés pour produire une image maximale projetée pour minimiser le chevauchement des foyers (Haut-chapeau filtre appliqué). </li><li> Metamorph (Molecular Devices, USA) a été utilisé pour analyser nombre de foyers. Le programme quantifie le nombre de foyers dans chaque cellule après que le seuil a été appliqué pour exclure de fond. Les informations sont enregistrées dans un tableur Microsoft Excel pour une analyse ultérieure. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1957/1957fig1.jpg" alt="Figure 1" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figure 1"> Figure 1. Visualisation par immunofluorescence de γH2AX foyers (en vert) dans les kératinocytes humains non traités et dans les cellules irradiées à 2 Gy et incubé pendant 1 heure à 37 ° C, 5% de CO 2. L'ADN a été coloré avec TOPRO-3 (bleu). Les images ont été acquises en utilisant un microscope Zeiss LSM 510 Meta confocale. Barre = 10 um. e_content "&gt; <img src="/files/ftp_upload/1957/1957fig2.jpg" alt="Figure 2" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figure 2"> Figure 2. Visualisation par immunofluorescence de γH2AX foyers (en vert) dans les kératinocytes humains et dans les cellules irradiées à 2 Gy et incubé pendant 1 heure à 37 ° C, 5% de CO 2. Les images ont été acquises en utilisant un microscope Zeiss LSM 510 Meta confocale utilisant 0,5 um-Z sectionnement (1-9) pour s'assurer que tous les foyers ont été acquises. Les images a ensuite été empilées pour la quantification en utilisant Metamorph. L'ADN a été coloré avec TOPRO-3 (bleu). Le γH2AX empilés et images bleues ont été empilées pour la visualisation. Barre = 10 um.

<ol><li>Rogakou, E. P., Boon, C., Redon, C., Bonner, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Megabase+chromatin+domains+involved+in+DNA+double-strand+breaks+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Megabase chromatin domains involved in DNA double-strand breaks in vivo.</a> J. Cell Biol. 146, 905-916 (1999).</li>
<li>Bonner, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gamma+H2AX+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Gamma H2AX and cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 8 (12), 957-967 (2008).</li>
<li>Savic, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+Dynamic+%5Bgamma%5D-H2AX+Domains+along+Broken+DNA+Strands+Is+Distinctly+Regulated+by+ATM+and+MDC1+and+Dependent+upon+H2AX+Densities+in+Chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Formation of Dynamic [gamma]-H2AX Domains along Broken DNA Strands Is Distinctly Regulated by ATM and MDC1 and Dependent upon H2AX Densities in Chromatin.</a> Molecular Cell. 34 (3), 298-310 (2009).</li>
<li>Downs, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Binding+of+chromatin-modifying+activities+to+phosphorylated+histone+H2A+at+DNA+damage+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Binding of chromatin-modifying activities to phosphorylated histone H2A at DNA damage sites.</a> Mol Cell. 16 (6), 979-990 (2004).</li>
<li>Chowdhury, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%5Bgamma%5D-H2AX+Dephosphorylation+by+Protein+Phosphatase+2A+Facilitates+DNA+Double-Strand+Break+Repair%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">[gamma]-H2AX Dephosphorylation by Protein Phosphatase 2A Facilitates DNA Double-Strand Break Repair.</a> Molecular Cell. 20 (5), 801-809 (2005).</li>
<li>Nakada, S., Chen, G., Gingras, A., Durocher, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PP4+is+a+gamma+H2AX+phosphatase+required+for+recovery+from+the+DNA+damage+checkpoint%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">PP4 is a gamma H2AX phosphatase required for recovery from the DNA damage checkpoint.</a> EMBO Rep. 9 (10), 1019-1026 (2008).</li>
<li>Altaf, M., Auger, A., Covic, M., Côté, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Connection+between+histone+H2A+variants+and+chromatin+remodeling+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Connection between histone H2A variants and chromatin remodeling complexes.</a> Biochem Cell Biol. 87 (1), 35-50 (2009).</li>
<li>Kusch, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acetylation+by+Tip60+Is+Required+for+Selective+Histone+Variant+Exchange+at+DNA+Lesions%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Acetylation by Tip60 Is Required for Selective Histone Variant Exchange at DNA Lesions.</a> Science. 306, 2084-2087 (2004).</li>
<li>Hurlin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progression+of+human+papillomavirus+type+18-immortalized+human+keratinocytes+to+a+malignant+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Progression of human papillomavirus type 18-immortalized human keratinocytes to a malignant phenotype.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 88 (2), 570-574 (1991).</li>
<li>Dickey, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((H2AX%3A+functional+roles+and+potential+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosoma%22%5BJournal%5D)">H2AX: functional roles and potential applications.</a> Chromosoma. , Forthcoming (2009).</li>
</ol>

Après une exposition à des rayonnements ionisants (γ-rayons), γH2AX foyers se forment rapidement et les numéros de foyers atteindre un maximum entre 30-60 minutes 2. Par conséquent, nos 1 point de temps heures après l&#39;irradiation initiale reflète la formation de l&#39;ORD. Nous avons utilisé la dose de rayonnement cliniquement pertinente de 2 Gy pour notre expérience. Cependant, la méthode peut être utilisée pour des doses de rayonnement jusqu&#39;à 4 Gy pour la détection de l&#39;ORD formation initiale; ...

<table><tbody><tr><td>Milieu sans sérum pour kératinocytes (K-SFM)</td><td>Milieu</td><td>Invitrogen</td><td>17005042</td><td>Milieu pour kératinocytes supplémenté en facteur de croissance épidermique recombinant humain 1-53 (EGF 1-53) et en extrait d'hypophyse bovine (BPE).</td></tr><tr><td>Lames à chambre Lab Tek II (8 puits)</td><td>Lames à chambre</td><td>Nalge Nunc international</td><td>NUN154534</td><td></td></tr><tr><td>Couvre-objets (22x50 mm)</td><td>Couvre-objets</td><td>Menzel-Glaser</td><td>CS2250100</td><td></td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine (BSA)</td><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td>La BSA (1 %) sert à bloquer toute liaison non spécifique des anticorps. Les anticorps primaires et secondaires sont dilués dans de la BSA.</td></tr><tr><td>PBS (sans Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; et Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;)</td><td></td><td>Invitrogen</td><td>17-517Q</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine-EDTA 0,5 % x10</td><td></td><td>Invitrogen</td><td>15400-054</td><td>La trypsine-EDTA (0,05 %) est utilisée pour détacher les cellules des flacons de culture.</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Réactif</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td>Le Triton X-100 (0,1 %) est utilisé pour rendre les cellules perméables.</td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde</td><td>Réactif</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td>Le paraformaldéhyde (4 %) est utilisé pour fixer les cellules.</td></tr><tr><td>Anticorps monoclonal de souris anti-histone-H2AX phosphorylée</td><td>Anticorps primaire</td><td>EMD Millipore</td><td>16193</td><td>Dilution de l'anticorps primaire (1:500) dans de la BSA à 1 %.</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 anti-IgG de chèvre (H+L)</td><td>Anticorps secondaire</td><td>Invitrogen</td><td>11029</td><td>Dilution de l'anticorps secondaire (1:500) dans de la BSA à 1 %.</td></tr><tr><td>TOPRO3</td><td>Colorant de l'ADN</td><td>Invitrogen</td><td>T3605</td><td>Colorant de l'ADN couramment utilisé : chlorure de 4,6-diamidino-2-phénylindole dihydrochlorure (DAPI). Ne peut être utilisé qu'avec des microscopes équipés du laser d'excitation approprié.</td></tr><tr><td>ProLong Gold</td><td>Solution anti-fade</td><td>Invitrogen</td><td>P36930</td><td>Indice de réfraction de 1,42 à 20&amp;#x00B0;C.</td></tr><tr><td>Flacon de culture cellulaire, bouchon ventilé</td><td>Flacon de culture</td><td>BD Biosciences</td><td>353112</td><td></td></tr><tr><td>Boîte de Pétri pour culture tissulaire (150x25 mm)</td><td>Boîte de Pétri</td><td>BD Biosciences</td><td>353025</td><td></td></tr><tr><td>Bocal Coplin, en verre</td><td></td><td>Grale Scientific P/L</td><td>1771-OG</td><td></td></tr><tr><td>Bac de coloration</td><td></td><td>Grale Scientific P/L</td><td>V1991.99</td><td></td></tr><tr><td>Irradiateur GammaCell 1000 Elite</td><td>Irradiateur gamma</td><td>Nordion International Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zeiss LSM 510 Meta Confocal</td><td>Microscope confocal</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Metamorph</td><td>Logiciel d'analyse d'images</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

quantification des γh2ax foci en réponse aux radiations ionisantes

Quantification of &gamma;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

L&#39;ADN des cassures double brin (CDB), qui sont induits soit par des processus métaboliques endogènes ou par des sources exogènes, sont l&#39;une des lésions de l&#39;ADN les plus critiques à l&#39;égard de la survie et la préservation de l&#39;intégrité du génome. Une réponse précoce à l&#39;induction de CDB est la phosphorylation de la H2A variant d&#39;histone, H2AX, à la sérine-139 résidus, dans le très conservé C-terminal motif SQEY, formant γH2AX<sup&gt; 1</sup&gt;. Après induction de CDB, H2AX est rapidement phosphorylée par la phosphatidyl-inosito 3-kinase (PIKK) famille de protéines, de l&#39;ataxie télangiectasie muté (ATM), sous-unité kinase ADN-protéines catalytiques et ATM et RAD3 liés (ATR)<sup&gt; 2</sup&gt;. Généralement, seuls quelques paires de bases (pb) sont impliqués dans un DSB, cependant, il ya amplification du signal significatif, étant donné l&#39;importance des modifications de la chromatine dans la signalisation des dommages de l&#39;ADN et de réparation. La phosphorylation de H2AX médiée principalement par l&#39;ATM se propage à des zones adjacentes de la chromatine, affectant environ 0,03% du total des cellulaires H2AX par l&#39;ORD<sup&gt; 2,3</sup&gt;. Cela correspond à la phosphorylation d&#39;environ 2000 molécules H2AX couvrant ~ 2 Mbp régions de la chromatine autour du site de l&#39;ORD et les résultats dans la formation de foyers discrets γH2AX qui peuvent être facilement visualisés et quantifiés par immunofluorescence<sup&gt; 2</sup&gt;. La perte de γH2AX au ORD reflète réparation, cependant, il ya une certaine controverse quant à ce qui définit la réparation complète de CDB, il a été proposé que des rejoignant les deux brins de l&#39;ADN est suffisante cependant, il a également été suggéré que la réintégration de l&#39; Etat d&#39;origine de la chromatine compactage est nécessaire<sup&gt; 4-8</sup&gt;. La disparition de γH2AX implique au moins en partie, la déphosphorylation par des phosphatases, la phosphatase 2A et la phosphatase 4C<sup&gt; 5,6</sup&gt;. En outre, la suppression des γH2AX par la redistribution impliquant un échange avec les histone H2A.Z a été impliquée<sup&gt; 7,8</sup&gt;. Surtout, l&#39;analyse quantitative des γH2AX foyers a conduit à une large gamme d&#39;applications en recherche médicale et nucléaire. Ici, nous démontrons la méthode la plus couramment utilisée par immunofluorescence pour l&#39;évaluation des dommages à l&#39;ADN initial par la détection et la quantification de γH2AX foyers dans γ-irradiés adhérente kératinocytes humains<sup&gt; 9</sup&gt;.

La quantification de l&#39;ADN double-brin de stries en utilisant la formation γH2AX comme marqueur moléculaire est devenu un outil précieux dans la radiobiologie. Ici nous démontrons l&#39;utilisation d&#39;un test d&#39;immunofluorescence pour la quantification des γH2AX foyers après exposition des cellules aux radiations.

Quantification des γH2AX Foci en réponse aux radiations ionisantes

Les cassures double-brin (CDB) de l'ADN, induites soit par des processus métaboliques endogènes, soit par des sources exogènes, constituent l'une des lésions de l'ADN les plus critiques...

Bonjour, je suis Ian Ma du laboratoire de médecine épigénomique dirigé par le Dr. Tom Caris à l'Institut Baker pour les yeux, le cœur et le diabète. Je réalise actuellement mon doctorat, qui porte principalement sur les effets des radiations sur la Gamma H deux A X, qui est le marqueur moléculaire des cassures double brin. Aujourd'hui, je vais démontrer une expérience sur la quantification de l'expression de la Gamma H deux A X en réponse aux radiations gamma chez des cellules humaines.Ce protocole d'immunomarquage peut être utilisé pour surveiller à la fois les lésions initiales de l'ADN ainsi que la réparation de l'ADN. Cette méthode est également utile pour évaluer l'efficacité de composés modificateurs potentiels des radiations. Par exemple, les radiosensibilisateurs, qui sont censés augmenter les lésions de l'ADN, entraîneront un nombre plus élevé de gamma H two A X four side, tandis que les radioprotecteurs auraient l'effet inverse, avec un nombre réduit de ForSight détecté en raison d'une diminution des cassures double brin de l'ADN.Commençons maintenant l'expérience. Les cellules utilisées dans cette expérience sont des cytes humaines, préparées sur des lamelles-chambre ave

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La quantification de l'ADN double-brin de brise sur la base de γH2AX foyers est devenu un outil précieux, en particulier dans la radiobiologie, pour l'évaluation de la radiosensibilité des tissus et des effets des rayonnements composés de modification. Ici nous démontrons l'utilisation d'un test d'immunofluorescence pour la quantification des γH2AX foyers dans des échantillons de tissus.

La quantification de γH2AX Foci dans les échantillons de tissus

L'analyse microscopique des γH2AX foyers, qui forment la suite de la phosphorylation de H2AX à Ser-139, en réponse à l'ADN des cassures double brin, est devenu un outil précieux dans la radiobiologie. Ici nous avons utilisé un anticorps mono-méthylé histone H3 lysine à 4 comme un marqueur épigénétique de la transcription euchromatine active, afin d'évaluer la distribution spatiale du rayonnement induit par la formation γH2AX au sein du noyau.

Évaluation de la distribution spatiale des rayonnements ionisants suivantes γH2AX

Un protocole pour évaluer les changements dans les niveaux de dommages à l’ADN et la capacité de réparation de l’ADN qui peuvent être induits par l’irradiation chronique in vivo à faible dose dans les lymphocytes de la rate de souris, en mesurant l’histone phosphorylée H2AX, un marqueur des cassures double brin de l’ADN, à l’aide de la cytométrie en flux est présenté.

Mesure de dommages et réparation de l&#39;ADN dans les splénocytes de souris Après chronique<em&gt; In Vivo</em&gt; L&#39;exposition à de très faibles doses de bêta et gamma Rayonnement

Ce manuscrit fournit un protocole pour l’analyse des cassures double brin de l’ADN par la microscopie en immunofluorescence de γH2AX et 53BP1.

La microscopie en immunofluorescence de γH2AX et 53BP1 pour l’analyse de la Formation et la réparation des cassures Double brin de l’ADN

Réparation des cassures double brin de l’ADN est un processus dynamique, qui exige non seulement la formation de complexes de réparation sur les sauts, mais également leur résolution après que la lésion est adressée. Ici, nous utilisons la microscopie d’immunofluorescence pour les pauses bicaténaire transitoires et de longue durée comme outil de disséquer ce mécanisme de maintenance du génome.

Caractériser les processus de réparation de l’ADN à des cassures de l’ADN bicaténaires durables et transitoires de la microscopie par Immunofluorescence

La méthode présentée combine l'analyse quantitative des ruptures à double brin d'ADN (DSB), de la distribution du cycle cellulaire et de l'apoptose pour permettre l'évaluation par cycle cellulaire de l'induction et de la réparation de l'ASD ainsi que les conséquences d'une défaillance de réparation.

Mesure spécifique au cycle cellulaire de h2AX et d'apoptose après stress génotoxique par cytométrie de flux

La réponse aux dommages causés par l’ADN par rayonnement activé par le faisceau mixte de neutrons utilisé dans la thérapie de capture de neutrons de bore (BNCT) n’a pas été entièrement établie. Ce protocole fournit une procédure étape par étape pour détecter les foyers induits par rayonnement (RIF) des protéines de réparation par la coloration d’immunofluorescence dans les lignées cellulaires du cancer du côlon humain après irradiation avec le faisceau mélangé à neutrons.

Imagerie d’immunofluorescence des dommages d’ADN et des foyers de réparation dans les cellules cancéreuses du côlon humain

Suite à des dommages à l’ADN, les cellules humaines activent des voies de réparation essentielles pour restaurer l’intégrité de leur génome. Ici, nous décrivons la méthode de l’immunofluorescence indirecte comme un moyen de détecter les protéines de réparation de l’ADN, d’analyser leur recrutement spatial et temporel, et d’aider à interroger l’interaction protéine-protéine sur les sites de dommages à l’ADN.

Visualisation de l’ADN Réparation des protéines Interaction par immunofluorescence

Ce protocole présente la préparation des lames et la notation automatisée du test des foyers γ-H2AX sur les lymphocytes du sang périphérique. Pour illustrer la méthode et la sensibilité du test, des lymphocytes isolés ont été irradiés in vitro. Cette méthode automatisée de détection de l’ADN DSB est utile pour les applications de dosimétrie biologique rapides et à haut débit.

Une méthode de notation microscopique automatisée pour le test de foyers γ-H2AX dans les lymphocytes du sang périphérique humain

Ce protocole présente une méthode pour évaluer la formation et la réparation des cassures double brin d’ADN par la détection simultanée des foyers γH2AX et 53BP1 dans les noyaux interphasiques des lymphocytes périphériques humains traités à la bléomycine.

Double immunofluorescence de γH2AX et 53BP1 dans les lymphocytes périphériques humains

Ici, nous présentons un protocole simple et rapide pour la détection de l’interaction protéique aux sites de dommages à l’ADN.

Dosage des ligands de proximité pour localiser les protéines dans les sites de dommages à l’ADN

Découvrez la quantification des foci γH2AX par immunofluorescence pour évaluer les cassures double-brin de l'ADN dans des cellules humaines exposées aux radiations ionisantes. Cette méthode permet de surveiller les dommages initiaux et la réparation de l'ADN.

Quantification des γH2AX Foci en réponse aux radiations ionisantes

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