In vivo de détection des interactions protéine-protéine sur la micro-surfaces texturées

Il est particulièrement important de déchiffrer le réseau d'interactions des molécules dans les cellules vivantes afin de comprendre les mécanismes régulant le métabolisme et la fonction cellulaires. Un nombre croissant de méthodologies fournissant des informations qualitatives et quantitatives constitue le moteur de notre progression vers une vision globale de la fonction cellulaire. Les essais de co-immunoprécipitation, de marquage TAP ou de réticulation photochimique permettent la purification de pré-molécules in vitro.

En outre, plusieurs approches ont été conçues pour l'analyse des interactions protéiques dans la cellule vivante. Celles-ci incluent des criblages par double hybride ou des essais de complémentation de protéines fluorescentes. De plus, certaines approches spectroscopiques telles que le FRET ou la FCS, ainsi que des méthodes non spectroscopiques, ont été mises au point pour répondre à cette question.

Les techniques susmentionnées ont été mises au point pour enregistrer de grandes populations de cellules, mais souffrent d'être plutôt indirectes et donc peu quantitatives. En revanche, quelques approches quantitatives de pointe ont été introduites. Toutefois, il est difficile d'étendre le haut débit tout en combinant ses capacités avec la possibilité d'extraire des informations quantitatives.

Nous avons récemment mis au point un nouveau concept pour l'identification des interactions entre protéines. La technique de microstructuration présentée ici est une illustration schématique de grilles de SA microstructurées, sur lesquelles du BSA Sci cinq est imprimé sur des lamelles de verre fonctionnalisées, les espaces intermédiaires étant remplis par de la streptavidine, suivie de ligands biotinylés. Dans la plupart des cas, des anticorps dirigés contre la membrane.

Appât protéique dans des cellules cultivées sur des puces microbiotiques. L'appât sera disposé dans la membrane plasmique selon le micro-motif d'anticorps. Les interactions avec une deuxième protéine cible marquée de manière fluorescente sont analysées en mesurant le degré de co-localisation à l'aide d'un tampon en PDMS sur support silicium présentant un réseau de carrés définis par leur taille caractéristique et leur profondeur.

Les trois micromètres sont produits à partir d'un gel et découpés. Les tampons sont rincés avec de l'éthanol à 100 % et de l'eau doublement distillée et déionisée, puis séchés à l'azote préalablement. Ils sont incubés avec 0,67 milligramme par millilitre de sci-fi.

Solution de BSA marquée pendant 30 minutes à température ambiante pendant l'incubation, les lamelles en verre modifiées par époxyde sont nettoyées de la même manière. De la même manière après encrage, les tampons sont lavés avec du PBS et de l'eau. Pour le transfert de BSA sci cinq.

Un tampon est séché à l'azote et placé immédiatement après, sous son propre poids, sous une lame de verre pendant 30 minutes. L'emplacement du champ de micro motifs est marqué sur l'envers de la lame. Après retrait des tampons, les lames sont scellées avec des masques en silicone adhésif.

Les chambres sont chargées avec une solution de streptavidine à 50 microgrammes par millilitre, incubée pendant une heure, puis rincées avec un millilitre de PBS. Ensuite, les motifs de streptavidine sont incubés avec un anticorps biotinylé à 10 microgrammes par millilitre pendant une heure ; après un lavage au PBS, les cellules sont introduites dans la chambre. Lorsque les cellules se sont attachées à la surface, l'échantillon est prêt pour les mesures.

La seule exigence pour la détection est un microscope à fluorescence capable d'illuminer l'échantillon en configuration de réflexion totale interne. De tels systèmes sont disponibles commercialement auprès de différents fournisseurs et sont devenus faciles à manipuler pour l'utilisateur au cours des dernières années. Notre système de détection est installé sur un microscope à fluorescence en épi-illumination.

Les lasers à ions argon et krypton sont utilisés pour l'excitation sélective par fluorescence des échantillons marqués par fluorochromes. Les quatre échantillons sont illuminés selon une configuration de réflexion totale interne basée sur un objectif, en utilisant un objectif à immersion huile de forte ouverture numérique (NA) et de grandissement 100×. Après un filtrage approprié à l’aide de jeux de filtres standards, la fluorescence est projetée sur une caméra CCD à éclairage arrière. La lecture s’effectue en mode intégration avec retard temporel, ce qui permet de balayer de grandes surfaces d’échantillon. Pour cela, les échantillons sont déplacés à l’aide d’une platine motorisée XY synchronisée avec le décalage de ligne de la caméra.

Le faisceau laser réfléchi vers l'arrière est projeté sur une photodiode à deux segments, et le signal différentiel est utilisé pour commander un piézo Z afin d'assurer une refocalisation rapide. Le lecteur est équipé d'un système automatisé de maintien du focus fonctionnant pendant le processus de balayage, avec un premier balayage à 488 nanomètres pour l'excitation sélective de la GFP, et un second balayage à 647 nanomètres pour l'excitation sélective du PS Cinq. Pour l'analyse des données, nous utilisons un programme de calcul du contraste écrit en MATLAB, basé sur l'intensité de fluorescence à l'intérieur et à l'extérieur de la région marquée par l'anticorps.

Le niveau de contraste et, par conséquent, le degré d'interaction des protéines sont analysés afin d'effectuer un examen rapide d'un grand nombre de cellules. Des logiciels automatisés disponibles commercialement peuvent également être utilisés. Par exemple, le logiciel d'imagerie scan R proposé par Olympus a été testé avec succès pour l'évaluation du contraste dans des expériences de microstructuration.

Nous analysons l'interaction bien connue entre CD quatre et LCK dans les protéines du signalisation précoce des lymphocytes T, comme illustré ici. Le LCK marqué par fluorescence se redistribue clairement sur les régions recouvertes d'anticorps anti-CD quatre. La perturbation de la structure du « zinc clasp », qui constitue un site principal d'interaction entre ces deux protéines, par l'ajout d'un chélateur de zinc, réduit le contraste des micro-motifs de LCK.

En résumé, les principaux avantages de la technique de microstructuration sont les suivants : la quantification des interactions protéiques locales spatialement résolues. En outre, la détection d'interactions faibles également dans la membrane plasmique de cellules vivantes, la détection d'interactions modulées entre appât et proie, l'analyse de l'état basal, ainsi que l'applicabilité de l'approche pour le haut débit.