Name: In vivo de détection des interactions protéine-protéine sur la micro-surfaces texturées (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-03-19T17:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 42 s
Description: Découvrez une technique de micro-patterning pour quantifier les interactions protéine-protéine dans les cellules vivantes. Cette méthode haut débit permet de détecter les interactions faibles et modulées dans la membrane plasmique.

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Nous tenons à remercier Quentina Beatty, Université de Linz, en Autriche, pour son aide genre, Katharina Strub, Université de Genève, en Suisse, pour la construction d&#39;hCD71-GFP, et Daniel Legler, Université de Constance, en Suisse, pour le GPI-GFP -DAF construire. Ce travail a été soutenu par le Fonds autrichien pour la science (FWF; projet Y250-B03) et le projet GEN-AU du Ministère fédéral autrichien pour la science et la recherche.

Impression par microcontact: <ol><li> Découpez domaine de Microdétail du timbre en PDMS aide d'un scalpel </li><li> Lavez le champ contenant le Microdétail en le rinçant à l'éthanol (100%) et de l'eau distillée. </li><li> Sécher le timbre en PDMS à l'azote ou de gaz argon. </li><li> Pipeter 50 ul solution BSA-Cy5 travaux (0,67 mg / ml) sur le timbre en PDMS afin que l'ensemble du champ Microdétail est couverte de solution. Incuber pendant 30 min à température ambiante. </li><li> Lavez le domaine Microdétail en le rinçant à tampon phosphate salin (PBS) et de l'eau distillée. </li><li> Sécher le PDMS à l'azote ou de gaz argon. </li><li> Placez le timbre en PDMS sous son propre poids sur le milieu de l'un revêtement époxy lamelle et incuber pendant 30 min à température ambiante dans une boîte de Pétri. </li><li> Étiquette de la position du timbre en PDMS sur le dos de la lamelle et la bande du timbre de la lame avec une pince. </li><li> Coller une chambre de fermeture sécurisée hybridation sur le champ microcontact-imprimée sur la lamelle. L'étiquette permet de localiser le centre du terrain. </li><li> Pipeter 60 ul solution de travail de la streptavidine (50 pg / ml) dans la chambre de réaction et incuber l'échantillon pendant 60 min à température ambiante. </li><li> Laver l'échantillon avec 1 ml de PBS en ajoutant le tampon dans un port de la chambre et le retirer simultanément le second port avec une pompe. </li><li> Pipeter 60 pl solution biotinylé travaux d'anticorps (10 ug / ml dans du PBS supplémenté avec 0,1% de Tween 20; "PBST") dans la chambre de réaction et incuber pendant 60 min à température ambiante. </li><li> Laver l'échantillon avec 1 ml PBST et ensuite 1 ml de PBS en ajoutant le tampon dans un port de la chambre et le retirer de nouveau à la deuxième port avec une pompe. </li><li> Stocker les surfaces micropatterned en PBS dans le noir à température ambiante jusqu'à cellules sont prêtes pour l'ensemencement. </li></ol> L'incubation des cellules sur la surface micropatterned: <ol><li> Cultiver des cellules adhérentes à 50% de confluence dans une plaque de 3 cm de culture de tissu. </li><li> Détachez les cellules exprimant des protéines appâts et proies d'intérêt avec l'acide éthylènediamine (EDTA) et de solution de centrifugeuse 5 min à 1000 rpm. </li><li> Jeter le surnageant et dissoudre le culot cellulaire dans le milieu de croissance en fonction. </li><li> Centrifuger 5 min à 1000 rpm. </li><li> Jeter le surnageant et dissoudre le culot cellulaire dans un milieu de croissance approprié. </li><li> Bourse du PBS de la chambre de réaction sur la lamelle micropatterned par 60 pi de la suspension cellulaire. </li><li> Créer une chambre humidifiée par trempage d'une compresse stérile dans l'eau distillée et le mettre dans la boîte de Pétri pour empêcher l'échantillon de tourner à sec. </li><li> Incuber les cellules pendant une nuit à 37 ° C dans une atmosphère de CO 2 5% sur les surfaces micropatterned. </li><li> Avant d'analyser les cellules au microscope, l'échange du milieu par une solution de Hank s saline tamponnée dont Ca 2 + et Mg 2 +. </li></ol> Microscopie: <ol><li> La lamelle est placée sur une monture adaptée et la morphologie des cellules est contrôlée dans la lumière blanche. </li><li> La qualité de la BSA-Cy5 modèles est vérifiée par une excitation à 647 nm. </li><li> Micropatterns de protéines proies fluorescente (GFP ou YFP) sont enregistrés à 488 ou 514 nm sous réflexion totale (TIR) ​​d'excitation interne. </li></ol> Les résultats représentatifs: Si il ya une interaction entre les protéines cibles dans les cellules cultivées sur une surface micropatterned, la proie suivra la redistribution des appâts. Le Microdétail résultant peut être visualisé par le label de fluorescence de la protéine proie. Surtout le contraste obtenu fournit une mesure directe de la force d'interaction (voir Figure 1). Par conséquent, une simple évaluation de l'interaction des deux protéines devient possible - sans la nécessité de continuer à traiter les données mesurées primaire. <img src="/files/ftp_upload/1969/1969fig1.jpg" alt="Figure 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1"> Figure 1. Réarrangement de l'appât dans la membrane plasmique de cellules vivantes à des forces d'interaction différents. TIR images de cellules transfectées avec T24 (a) CD71-CD71-GFP sur des anticorps, (b) des CD4 et la YFP cytosolique sur les cellules CD4-anticorps et (c) GPI-GFP-DAF sur la CD59-anticorps microbiochips sont affichés. Les données sont caractéristiques de forte (a), non (b) ou interaction faible (c). (A) est reproduite à partir de (Weghuber et al., Sous presse), (b) de (Schwarzenbacher et al., 2008).

<ol><li>Brameshuber, M., Schwarzenbacher, M., Kaltenbrunner, M., Hesch, C., Paster, W., Weghuber, J., Heise, B., Sonnleitner, A., Stockinger, H., Schuetz, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reply+to+%22Uncoupling+diffusion+and+binding+in+FRAP+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Reply to "Uncoupling diffusion and binding in FRAP experiments.</a> Nat. Methods. 6, 183-184 (2009).</li>
<li>Kim, P. W., Sun, Z. J., Blacklow, S. C., Wagner, G., Eck, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Zinc+Clasp+Structure+Tethers+Lck+to+T+Cell+Coreceptors+CD4+and+CD8%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A Zinc Clasp Structure Tethers Lck to T Cell Coreceptors CD4 and CD8.</a> Science. 301, 1725-1728 (2003).</li>
<li>Ramm, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image-based+screening%3A+a+technology+in+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Image-based screening: a technology in transition.</a> Curr. Opin. Biotechnol. 16, 41-48 (2005).</li>
<li>Schwarzenbacher, M., Kaltenbrunner, M., Brameshuber, M., Hesch, C., Paster, W., Weghuber, J., Heise, B., Sonnleitner, A., Stockinger, H., Schutz, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micropatterning+for+quantitative+analysis+of+protein-protein+interactions+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Micropatterning for quantitative analysis of protein-protein interactions in living cells.</a> Nat. Methods. 5, 1053-1060 (2008).</li>
<li>Weghuber, J., Brameshuber, M., Sunzenauer, S., Lehner, M., Paar, C., Haselbruebler, T., Schwarzenbacher, M., Kaltenbrunner, M., Paster, W., Heise, B., Sonnleitner, A., Stockinger, H., Schutz, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+protein-protein+interactions+in+the+live+cell+plasma+membrane+by+quantifying+prey+redistribution+upon+bait+micropatterning%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Detection of protein-protein interactions in the live cell plasma membrane by quantifying prey redistribution upon bait micropatterning.</a> Methods in Enzymology. , Forthcoming Forthcoming.</li>
</ol>

La vidéo contient des images qui ont été fournis par Olympus, tiré de la page d&#39;accueil du laboratoire de recherche de visualisation, l&#39;Université Brown ou reproduits à partir (Kim et al., 2003).

La vidéo qui l&#39;accompagne montre une méthode pour détecter les interactions protéine-protéine dans le plasma de la membrane des cellules vivantes (Schwarzenbacher et al, 2008;. Brameshuber et al, 2009;.. Weghuber et al, sous presse). En principe, n&#39;importe quelle plateforme de microscopie TIRF basé peut être utilisé comme système de lecture. Ce n&#39;est que lorsque la sensibilité élevée est souhaitée (par exemple pour la détection de molécules uniques), les microscopes de pointe seront nécessaires. Pour obtenir les meilleurs résultats les points critiques suivants pendant le processus de préparation nécessitent une attention particulière: <ol class="lroman"><li> Magasin de Cy5-solution-mère dans des conditions sombres pour éviter le blanchiment du fluorophore et préparer la BSA-Cy5 solution de travail fraîchement avant l&#39;impression par microcontact. </li><li> Attention à ne pas rayer la Microdétail sur le PDMS avec la pointe de la pipette et incuber l&#39;échantillon dans des conditions sombres pour éviter le blanchiment du fluorophore. </li><li> Mettez la lamelle sur une compresse stérile pour empêcher le collage de la lame de verre pour la boîte de Pétri. Une fois le timbre en PDMS a adhéré à la lame de verre, ne pas le déplacer. </li><li> Eviter les bulles d&#39;air dans la chambre de réaction et incuber l&#39;échantillon dans des conditions sombres pour éviter le blanchiment du fluorophore. </li><li> Ne laissez pas l&#39;échantillon sec pendant plus de 2 minutes pour éviter la formation de cristaux de sel. </li><li> Pour le détachement des cellules de ne pas utiliser la trypsine comme il cliver le domaine extracellulaire de protéines membranaires jusqu&#39;à présent exprimé. Eviter la trypsine sera utile pour les protéines avec faible taux de rotation pour former micropatterns immédiatement après la fixation des cellules sur la surface. </li><li> Contrôle le nombre de cellules incubées dans un microscope et faire en sorte que les cellules n&#39;atteignent pas plus de 30-50% de confluence. Assurez-vous que les cellules excès sont enlevés immédiatement en raison de la fixation rapide des cellules sur la surface revêtue d&#39;anticorps. </li><li> Seules les diapositives de haute qualité BSA-Cy5 modèles peuvent être utilisés pour une analyse ultérieure. </li><li> Une expression stable de la protéine fluorescente est préférable proies due à une plus grande nombre de cellules qui peuvent être analysées par balayage. </li><li> Adéquate de réglage FRBR est indispensable pour visualiser les modèles en raison de fond cytosolique. </li></ol> La technique de micro-motifs propose plusieurs possibilités pour l&#39;analyse des interactions protéine-protéine. Tout d&#39;abord, avec la quantification des locaux, résolues spatialement interactions protéine-protéine a également la détection des interactions faibles ou indirecte n&#39;est possible sans l&#39;inconvénient de donner un nombre élevé de faux positifs ou négatifs. Deuxièmement, elle permet au chercheur d&#39;analyser les interactions entre protéines dans le plasma de la membrane des cellules vivantes, ce qui est difficile à réaliser par des approches biochimiques comme l&#39;écran 2-hybride. Troisièmement, l&#39;approche permet la détection de l&#39;appât-proie interactions qui sont modulés par les changements environnementaux comme la température, la présence de différentes protéines ou autres molécules ou modifications post-traductionnelles. Ainsi, le test de dépistage permet de modulateurs de l&#39;interaction d&#39;une paire donnée dans le contexte de cellules vivantes. Par ailleurs, en réduisant la densité de surface du ligand de capture ou de l&#39;utilisation de ligands monovalents, l&#39;analyse de l&#39;état de repos devient possible. Enfin, si les plates-formes adéquates de numérisation sont utilisés, le nombre de cellules analysées est suffisamment élevé pour correspondre à la demande haut débit des entreprises pharmaceutiques pour le dépistage de drogue (Ramm, 2005).

in vivo de détection des interactions protéine-protéine sur la micro-surfaces texturées

In-vivo Detection of Protein-protein Interactions on Micro-patterned Surfaces

Démêler le réseau d&#39;interaction des molécules<em&gt; In vivo</em&gt; Est la clé de la compréhension des mécanismes qui régulent la fonction cellulaire et du métabolisme. Une multitude d&#39;options méthodologiques pour aborder les interactions moléculaires dans les cellules ont été développés, mais la plupart de ces méthodes souffrent d&#39;être plutôt indirect et par conséquent guère quantitatives. Au contraire, quelques-uns de haut de gamme des approches quantitatives ont été introduites, qui sont toutefois difficile à étendre à haut débit. Pour combiner des capacités haut débit avec la possibilité d&#39;extraire des informations quantitatives, nous avons récemment développé un nouveau concept d&#39;identification des interactions protéine-protéine (Schwarzenbacher<em&gt; Et al</em&gt;., 2008). Ici, nous décrivons un protocole détaillé pour la conception et la construction de ce système qui permet d&#39;analyser les interactions entre un fluorophore protéine marquée («proie») et une protéine de membrane («appât»)<em&gt; In vivo</em&gt;. Les cellules sont étalées sur des surfaces fonctionnalisées micropatterned avec des anticorps contre le domaine des appâts exoplasmic. Appât-proie interactions sont analysés à travers la redistribution de la proie fluorescentes. La méthode est caractérisée par une sensibilité élevée jusqu&#39;au niveau de molécules uniques, la capacité de détecter des interactions faibles, et la capacité de débit élevé, rendant applicable comme outil de dépistage.

Cette vidéo montre des expériences avec l&#39;analyse subséquente des interactions protéine-protéine par l&#39;utilisation de micro-surfaces texturées. L&#39;approche offre la possibilité de détecter les interactions entre protéines dans les cellules vivantes et combine haute capacité de débit avec la possibilité d&#39;extraire des informations quantitatives.

In vivo de détection des interactions protéine-protéine sur la micro-surfaces texturées

L'élucidation du réseau d'interactions moléculaires in vivo est essentielle pour comprendre les mécanismes qui régulent la fonction et le métabolisme cellulaires. Une multitude de...

Il est particulièrement important de déchiffrer le réseau d'interactions des molécules dans les cellules vivantes afin de comprendre les mécanismes régulant le métabolisme et la fonction cellulaires. Un nombre croissant de méthodologies fournissant des informations qualitatives et quantitatives constitue le moteur de notre progression vers une vision globale de la fonction cellulaire. Les essais de co-immunoprécipitation, de marquage TAP ou de réticulation photochimique permettent la purification de pré-molécules in vitro.En outre, plusieurs approches ont été conçues pour l'analyse des interactions protéiques dans la cellule vivante. Celles-ci incluent des criblages par double hybride ou des essais de complémentation de protéines fluorescentes. De plus, certaines approches spectroscopiques telles que le FRET ou la FCS, ainsi que des méthodes non spectroscopiques, ont été mises au point pour répondre à cette question.Les techniques susmentionnées ont été mises au point pour enregistrer de grandes populations de cellules, mais souffrent d'être plutôt indirectes et donc peu quantitatives. En revanche, quelques approches quantitatives de pointe ont été introduites. Toutefois, il est difficile d'étendre le haut débit tout en combinant ses capacités avec la possibilité d'extraire des informations quantitatives.Nous avons récemment mis au point un nouveau concept pour l'identification des interactions entre protéines. La technique de microstructuration présentée ici est une illustration schématique de grilles de SA microstructurées, sur lesquelles du BSA Sci cinq est imprimé sur des lamelles de verre fonctionnalisées, les espaces intermédiaires étant remplis par de la streptavidine, suivie de ligands biotinylés. Dans la plupart des cas, des anticorps dirigés contre la membrane.Appât protéique dans des cellules cultivées sur des puces microbiotiques. L'appât sera disposé dans la membrane plasmique selon le micro-motif d'anticorps. Les interactions avec une deuxième protéine cible marquée de manière fluorescente sont analysées en mesurant le degré de co-localisation à l'aide d'un tampon en PDMS sur support silicium présentant un réseau de carrés définis par leur taille caractéristique et leur profondeur.Les trois micromètres sont produits à partir d'un gel et découpés. Les tampons sont rincés avec de l'éthanol à 100 % et de l'eau doublement distillée et déionisée, puis séchés à l'azote préalablement. Ils sont incubés avec 0,67 milligramme par millilitre de sci-fi.Solution de BSA marquée pendant 30 minutes à température ambiante pendant l'incubation, les lamelles en verre modifiées par époxyde sont nettoyées de la même manière. De la même manière après encrage, les tampons sont lavés avec du PBS et de l'eau. Pour le transfert de BSA sci cinq.Un tampon est séché à l'azote et placé immédiatement après, sous son propre poids, sous une lame de verre pendant 30 minutes. L'emplacement du champ de micro motifs est marqué sur l'envers de la lame. Après retrait des tampons, les lames sont scellées avec des masques en silicone adhésif.Les chambres sont chargées avec une solution de streptavidine à 50 microgrammes par millilitre, incubée pendant une heure, puis rincées avec un millilitre de PBS. Ensuite, les motifs de streptavidine sont incubés avec un anticorps biotinylé à 10 microgrammes par millilitre pendant une heure ; après un lavage au PBS, les cellules sont introduites dans la chambre. Lorsque les cellules se sont attachées à la surface, l'échantillon est prêt pour les mesures.La seule exigence pour la détection est un microscope à fluorescence capable d'illuminer l'échantillon en configuration de réflexion totale interne. De tels systèmes sont disponibles commercialement auprès de différents fournisseurs et sont devenus faciles à manipuler pour l'utilisateur au cours des dernières années. Notre système de détection est installé sur un microscope à fluorescence en épi-illumination.Les lasers à ions argon et krypton sont utilisés pour l'excitation sélective par fluorescence des échantillons marqués par fluorochromes. Les quatre échantillons sont illuminés selon une configuration de réflexion totale interne basée sur un objectif, en utilisant un objectif à immersion huile de forte ouverture numérique (NA) et de grandissement 100×. Après un filtrage approprié à l’aide de jeux de filtres standards, la fluorescence est projetée sur une caméra CCD à éclairage arrière. La lecture s’effectue en mode intégration avec retard temporel, ce qui permet de balayer de grandes surfaces d’échantillon. Pour cela, les échantillons sont déplacés à l’aide d’une platine motorisée XY synchronisée avec le décalage de ligne de la caméra.Le faisceau laser réfléchi vers l'arrière est projeté sur une photodiode à deux segments, et le signal différentiel est utilisé pour commander un piézo Z afin d'assurer une refocalisation rapide. Le lecteur est équipé d'un système automatisé de maintien du focus fonctionnant pendant le processus de balayage, avec un premier balayage à 488 nanomètres pour l'excitation sélective de la GFP, et un second balayage à 647 nanomètres pour l'excitation sélective du PS Cinq. Pour l'analyse des données, nous utilisons un programme de calcul du contraste écrit en MATLAB, basé sur l'intensité de fluorescence à l'intérieur et à l'extérieur de la région marquée par l'anticorps.Le niveau de contraste et, par conséquent, le degré d'interaction des protéines sont analysés afin d'effectuer un examen rapide d'un grand nombre de cellules. Des logiciels automatisés disponibles commercialement peuvent également être utilisés. Par exemple, le logiciel d'imagerie scan R proposé par Olympus a été testé avec succès pour l'évaluation du contraste dans des expériences de microstructuration.Nous analysons l'interaction bien connue entre CD quatre et LCK dans les protéines du signalisation précoce des lymphocytes T, comme illustré ici. Le LCK marqué par fluorescence se redistribue clairement sur les régions recouvertes d'anticorps anti-CD quatre. La perturbation de la structure du « zinc clasp », qui constitue un site principal d'interaction entre ces deux protéines, par l'ajout d'un chélateur de zinc, réduit le contraste des micro-motifs de LCK.En résumé, les principaux avantages de la technique de microstructuration sont les suivants : la quantification des interactions protéiques locales spatialement résolues. En outre, la détection d'interactions faibles également dans la membrane plasmique de cellules vivantes, la détection d'interactions modulées entre appât et proie, l'analyse de l'état basal, ainsi que l'applicabilité de l'approche pour le haut débit.

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