Name: Modèle murin Bioluminescent tumeurs hépatiques (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-07-17T17:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 23 s
Description: Découvrez une technique chirurgicale pour induire des tumeurs hépatiques bioluminescentes orthotopiques chez la souris. Cette méthode permet l'analyse de la croissance tumorale par imagerie luminescente in vivo pour la recherche oncologique.

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Ce travail a été financé par le Cork South Victoria Infirmary Hospital de l&#39;Université de fonds du sein, cancer de la Société irlandaise (CRI07TAN) et le Centre de recherche contre le cancer Cork. Ligne de cellules du poumon de Lewis exprimant de façon stable la luciférase a été un cadeau du genre Dr. Karin Jooss, Cell Genesys, Inc, San Francisco, USA.

Présentation Le foie est souvent le premier site de la maladie métastatique et peut être le seul site de dissémination dans autant que 30 à 40% des patients ayant une maladie avancée. Toutefois les options pour traiter des tumeurs hépatiques métastatiques sont rares avec une minorité de patients appropriés pour la résection et seulement 23% des intervenants majeurs aux agents chimiothérapeutiques. La recherche préclinique dans ce domaine ont été limitées par l'absence d'un modèle de souris adaptée à l'étude des maladies hépatiques isolées. Nous décrivons une approche split-rate qui peuvent être utilisées pour déterminer de manière sûre uniforme, métastases hépatiques diffuses. La résection de cette moitié de la rate permet d'éviter les conséquences de la croissance tumorale de la rate et l'autre moitié de la rate est retourné avec une circulation portale intacte pour maintenir spléniques immunitaires protectrices. Le modèle que nous décrivons est assez simple à réaliser et qui peut être fait rapidement par une seule incision. Les propriétés bioluminescentes de la lignée cellulaire tumorale permet une quantification précise de la réponse au traitement, sans sacrifice d'animaux. Protocole Préparation des cellules I. <ol><li> Cellules de carcinome pulmonaire de Lewis sont cultivés Dulbecco milieu modifié essentielles complétée par du sérum de veau foetal à 10% à 37 ° C, 5% de CO 2 et récoltées par trypsinisation lorsque les sous-confluentes. </li><li> Les cellules ont été comptées en utilisant un NucleoCounter (chimio-metec, Danemark) et une suspension cellulaire unique de 1 x 10 6 cellules dans 200 ul a été préparé dans le sérum des médias libres. </li></ol> II. Préparation de la souris Note: Toutes les procédures ont été approuvées par le comité d'éthique de l'Université de Cork. Dans notre laboratoire, nous utilisons des anesthésiques injectables pour anesthésier la souris, ou alternativement, on peut utiliser des anesthésiques inhalés pour atteindre le même effet. La souche de souris, nous avons utilisé est le poil MF1 nu / nu souche obtenue à partir Harlan Laboratories (Oxfordshire, Angleterre). Femme MF1 souris nu / nu pesant de 16 à 22 g et de 6-8 semaines d'âge ont été inclus dans cette expérience. D'autres souches comme le C57 et Balb / c peuvent également être utilisés avec les lignées cellulaires tumorales. <ol><li> L'anesthésie a été administré par injection intrapéritonéale de 100 ul de 1,5 mg de kétamine et de xylazine 300 ug. </li><li> La profondeur de l'anesthésie est évaluée à l'aide pincement de l'orteil. Il devrait y avoir aucun réflexe de retrait avec pincement de l'orteil. </li><li> La souris est positionné correctement anesthésiés et enregistrée sur un coussin chauffant. </li><li> L'abdomen est préparée avec une solution bétadine à 10%. </li><li> L'abdomen et du site opératoire sont drapées d'une manière stérile. </li></ol> III. Incision abdominale <ol><li> Une petite incision sous-costale est faite dans la peau. </li><li> L'incision est étendue à 2-3 cm. </li><li> La musculature de la paroi abdominale ont été divisés et la cavité péritonéale est entré. </li></ol> IV. L'exposition et la Division de la rate <ol><li> La rate est mobilisé et doucement extériorisé sur une gaze stérile, pré-coupés. </li><li> Deux 4-0 ligatures vicryl sont attachés autour du corps mi de la rate. </li><li> Spleen est divisé entre les deux ligatures la création de deux hémi-rate. </li></ol> Injection V. de cellules dans le Hemi-rate <ol><li> Un G 27 est utilisée pour injecter un volume de 100 ul de cellules dans un hémi-rate. </li><li> Les cellules tumorales sont autorisés à drainer le foie pendant dix minutes fournissant suffisamment de temps pour la majorité des cellules injectées pour atteindre le foie. </li></ol> VI. Excision de Hemi-rate, la fermeture abdominale et de récupération <ol><li> L'injection de l'hémi-rate est excisée. </li><li> L'autre hémi-rate est retourné à la cavité abdominale. </li><li> La couche musculaire est fermé par suture de PDS 4-0 en utilisant un simple point en marche. </li><li> La peau abdominale est fermée avec Prolène 4-0 points de suture à l'aide interrompue. </li><li> Fluide bolus est administré et l'analgésie postopératoire, Carpofen (5 mg / kg) est administré par injection IP pendant 24 heures après la chirurgie. </li><li> La souris est autorisé à remettre de l'anesthésie </li></ol> VII. IVIS corps entier Bioluminescent Imaging <ol><li> La souris est anesthésiée à l'aide anesthésique injectable. </li><li> Substrat luciférine est donnée par injection intra-péritonéale dix minutes avant l'imagerie </li><li> Les souris sont placées sur la scène et imagé pour 3 min à l'aide du système IVIS imagerie du corps entier </li><li> Luminescence du foie peut être mesurée en utilisant une région d'un outil d'intérêt </li></ol> VIII. L'exposition de foie de souris <ol><li> La souris est anesthésiée à l'aide anesthésique injectable. </li><li> Une incision abdominale sur le toit permet la visualisation des métastases hépatiques diffuses in vivo. </li><li> La souris est euthanasié par dislocation cervicale et le foie peut être excisée pour une analyse ultérieure. </li></ol>_upload/1977/1977fig1.jpg "alt =" Figure 1 "/&gt; Figure 1. Fraîchement excisés traités murines et tumorales infiltrées foies. <img src="/files/ftp_upload/1977/1977fig2.jpg" alt="Figure 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 2"> Figure 2. Cinétique de croissance de la tumeur hépatique comme en témoigne l'imagerie IVIS corps tout entier.

<ol><li>Kasuya, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+of+subcutaneous+spleen+reservoir+for+multiple+portal+venous+injections+to+treat+liver+malignancies%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Mouse models of subcutaneous spleen reservoir for multiple portal venous injections to treat liver malignancies.</a> Cancer Res. 65, 3823-3827 (2005).</li>
<li>Liu, Q. Z., Tuo, C. W., Wang, B., Wu, B. Q., Zhang, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver+metastasis+models+of+human+colorectal+carcinoma+established+in+nude+mice+by+orthotopic+transplantation+and+their+biologic+characteristic%5BTitle%5D)+AND+%22World+J+Gastroenterol%22%5BJournal%5D)">Liver metastasis models of human colorectal carcinoma established in nude mice by orthotopic transplantation and their biologic characteristic.</a> World J Gastroenterol. 4, 409-411 (1998).</li>
<li>Li, Z. Y., Ni, S., Yang, X., Kiviat, N., Lieber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenograft+models+for+liver+metastasis%3A+Relationship+between+tumor+morphology+and+adenovirus+vector+transduction%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Xenograft models for liver metastasis: Relationship between tumor morphology and adenovirus vector transduction.</a> Mol Ther. 9, 650-657 (2004).</li>
<li>Cashman, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+gene+therapy+as+a+neoadjuvant+to+surgical+excision+to+control+metastatic+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Lett%22%5BJournal%5D)">Immune gene therapy as a neoadjuvant to surgical excision to control metastatic cancers.</a> Cancer Lett. , (2008).</li>
</ol>

Le développement de la fiabilité des modèles in vivo pour l&#39;étude des métastases hépatiques est de plus en plus important avec l&#39;avènement de nouvelles stratégies thérapeutiques. Pour l&#39;étude précise de nouvelles stratégies, des modèles animaux devrait être relativement facile à réaliser, forment un nombre significatif de métastases, impliquer toutes les étapes de la cascade métastatique et ont un système rapporteur qui permet la détection et le comptage d&#39;un nombre limité de cellules m...

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6429</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Kétamine</td><td>V&amp;eacute;toquinol</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>V&amp;eacute;toquinol</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Carprofène</td><td>V&amp;eacute;toquinol</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vidène</td><td>Ecolab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fil de suture Vicryl 4-0</td><td>Ethicon Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fil de suture PDS 4-0</td><td>Ethicon Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fil de suture Prolene 4-0</td><td>Ethicon Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Luciférine de luciole</td><td>Biosynth International, Inc</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

modèle murin bioluminescent tumeurs hépatiques

Murine Bioluminescent Hepatic Tumour Model

Cette vidéo décrit l&#39;établissement de métastases hépatiques dans un modèle de souris qui peut ensuite être analysé par imagerie par bioluminescence. Les cellules tumorales sont administrés spécifiquement dans le foie pour induire une tumeur hépatique localisée, via la mobilisation de la rate et le fractionnement en deux, laissant intact le pédicule vasculaire pour chaque moitié de la rate. Cellules de carcinome pulmonaire de Lewis qui expriment constitutivement le gène luciférase de luciole (luc1) sont inoculées dans un hémi-rate qui est ensuite réséqué 10 minutes plus tard. L&#39;autre hémi-rate est laissé intact et est retourné à l&#39;abdomen. La croissance des tumeurs du foie peuvent être surveillés par imagerie par bioluminescence en utilisant l&#39;imagerie IVIS ensemble du système du corps. Imagerie quantitative de la croissance tumorale en utilisant IVIS fournit une quantification précise des cellules tumorales viables. La mort des cellules tumorales et la nécrose due à un traitement médicamenteux est indiqué au début par une réduction dans le signal de bioluminescence. Ce modèle de souris permet d&#39;étudier les mécanismes sous-jacents métastatique des tumeurs cellule de survie et de croissance et peut être utilisé pour l&#39;évaluation des traitements des métastases hépatiques.

Cet article décrit une procédure pour l&#39;induction de tumeurs du foie orthotopique chez des souris bioluminescentes, et l&#39;analyse ultérieure de la croissance tumorale limitées au foie en utilisant l&#39;imagerie en direct toute la luminescence du corps.

Modèle murin Bioluminescent tumeurs hépatiques

Cette vidéo décrit l'établissement de métastases hépatiques dans un modèle murin pouvant être analysé ultérieurement par imagerie bioluminescente. Les cellules tumorales sont...

Bonjour à tous. Je m'appelle Simon Regenron. Je suis l'un des chirurgiens inscrits au centre de recherche sur le cancer du rein ici en Irlande.Aujourd'hui, je vais vous montrer une technique chirurgicale permettant d'induire des métastases hépatiques. Dans un modèle murin, le foie est un site fréquent de dissémination métastatique et une cause majeure de mortalité liée au cancer. Seul un faible pourcentage de patients atteints d'une maladie hépatique avancée est éligible à une résection chirurgicale.Par conséquent, de nouveaux traitements sont nécessaires pour soigner cette affection. De nombreux modèles animaux de métastases hépatiques ne reproduisent pas une maladie comparable à la situation clinique. Le modèle que je vous présente aujourd'hui est un modèle cliniquement pertinent, relativement facile à maîtriser et offrant des taux de réussite très élevés.Ce modèle consiste à diviser la rate en deux hémirates. Une hémirate est utilisée pour l'inoculation de cellules tumorales. Ces cellules tumorales migrent à travers la circulation porte jusqu'au foie.La moitié restante de la rate est laissée intacte afin de préserver ses propriétés immunologiques. La lignée cellulaire utilisée exprime de manière stable la luciférase, permettant une analyse bioluminescente de la croissance tumorale in vivo. Ce modèle permettra donc une surveillance non invasive des thérapeutiques dans les maladies hépatiques.Très bien, commençons cette procédure aujourd'hui. Les instruments dont nous avons besoin sont des ciseaux de dissection, un porte-aiguille, deux pinces hémostatiques petites, un scalpel taille 10, un fil de suture Proline 5-0 pour la fermeture cutanée, un fil de suture PIA 4-0 pour la fermeture de la couche péritonéale, des ligatures Vicryl 3-0 pour la division de la rate, du sérum physiologique, une aiguille à insuline 29G pour l'injection d'anesthésique, une aiguille à insuline 26G pour l'injection de la suspension tumorale, la suspension de cellules tumorales en milieu sans sérum, un anesthésique injectable, un marqueur cutané, des compresses stériles prédécoupées. Le modèle murin que j'utiliserai aujourd'hui est la souris nude Athymique MF1.D'autres modèles, tels que les souris C 57 et BC, peuvent être utilisés avec des lignées cellulaires tumorales appropriées. Un tapis chauffant est utilisé, ainsi qu'un anesthésique général injectable en laboratoire. La profondeur de l'anesthésie est évaluée à l'aide de la pincée du orteil.Il ne devrait pas y avoir de réflexe de retrait des orteils lorsqu'on pince les orteils. La souris de taille moyenne est correctement positionnée et fixée avec du ruban adhésif, et l'abdomen est préparé avec du Bétadine et recouvert de manière stérile. Une incision sous-costale est pratiquée, la cavité abdominale est ouverte, la rate est identifiée et extériorisée.La rate est isolée du reste de la souris à l'aide d'une compresse stérile pré-découpée. Deux ligatures verticales sont passées entre les deux pédicules vasculaires et nouées délicatement. La rate est divisée en deux hémirates égales.Un hémispléen est utilisé pour l'inoculation des cellules tumorales. Les cellules tumorales sont injectées lentement dans l'hémispléen afin d'éviter toute fuite. Les cellules tumorales circulent via la circulation porte et atteignent le foie.Après 10 minutes d'incubation, l'hémisplène injecté est excisé et l'autre hémisplène est replacé dans l'abdomen. Des sutures résorbables et un point continu sont utilisés pour fermer la cavité péritonéale, et une suture non résorbable en proline 5-0 est utilisée pour la fermeture cutanée. La récupération est effectuée selon les procédures habituelles.Le développement de la maladie hépatique peut être évalué au fil du temps à l'aide d'imagerie ivus 2D. La souris est anesthésiée comme précédemment, et le substrat luciférine est administré par voie intrapéritonéale. La souris est placée sur la platine à l'intérieur de la chambre à 37 degrés.L'imagerie est réalisée pendant trois minutes et une image superposée de la souris avec la luminescence détectée est produite. Trois semaines après le traitement, l'abdomen est ouvert et une maladie hépatique diffuse est observée. En conclusion, cette technique permet l'induction d'une croissance tumorale métastatique localisée dans le foie ; l'imagerie luminescente permet la visualisation et la quantification de la croissance tumorale ainsi que son application dans l'évaluation des réponses thérapeutiques.

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