Génération de sphéroïdes à partir de lignées cellulaires : une méthode de culture cellulaire tridimensionnelle (3D)

Cultivez la lignée cellulaire souhaitée en tant que monocouche 2D adhérente. Retirez le milieu de culture et lavez-le avec une solution saline tamponnée au phosphate ou du PBS. Ensuite, ajoutez de la trypsine et incubez pendant que les cellules se détachent de la surface du ballon et deviennent de forme ronde. Ajoutez un milieu frais pour neutraliser la trypsine et suspendre les cellules. Transférez le mélange dans un tube conique et utilisez une centrifugeuse pour granuler les cellules.

Remplacez le surnageant par un milieu frais et remettez en suspension la pastille de la cellule. Utilisez un hémocytomètre pour compter le nombre de cellules et calculer une concentration de travail. Ensuite, transférez la bonne quantité de mélange cellulaire dans une plaque à puits à très faible adhérence à fond rond et incuberez. Les cellules se déposent au fond et s’agrègent. Ils finiront par s’attacher les uns aux autres et former un assemblage compact de cellules 3D, le sphéroïde.

Dans l’exemple de protocole, nous verrons comment générer des sphéroïdes 3D à partir d’une lignée cellulaire de cancer du côlon, et comment l’imagerie en direct est appliquée pour suivre leur formation. Commencez par laver la lignée cellulaire du cancer colorectal d’intérêt avec cinq millilitres de PBS et retirez les cellules du fond du ballon avec 0,5 millilitre de trypsine pendant cinq minutes à 37 degrés Celsius. Après avoir confirmé le détachement au microscope, neutralisez l’enzyme de dissociation cellulaire avec 10 millilitres de milieu complet et collectez les cellules par centrifugation. Remettez la pastille en suspension dans cinq millilitres de milieu complet frais pour le comptage, et remettez les cellules en suspension à une concentration de 1,5 fois 10 à la troisième cellule par millilitre.

Ensuite, ensemencez 20 microlitres de cellules dans chaque puits d’une plaque à fond rond de 96 puits et placez la plaque dans un appareil d’imagerie automatisé à l’intérieur d’un incubateur à 37 degrés Celsius avec 5 % de CO2 et 95 % d’humidité. Connectez-vous au logiciel d’acquisition de l’appareil et sélectionnez Planifier l’acquisition, Lancer l’ajout d’un navire, Scanner selon le calendrier et Créer un navire, Nouveau. Ensuite, sélectionnez Type de balayage, Sphéroïde et sélectionnez les canaux Fond clair et Fluorescence appropriés qui vous intéressent. Réglez le grossissement sur 10 fois et sélectionnez le modèle de plaque et sa position dans le tiroir de l’appareil d’imagerie. Sélectionnez la position des puits à imager et entrez la description de l’expérience, y compris le nom, le type de cellules et le nombre de cellules.

Pour la configuration de l’analyse, sélectionnez Différer l’analyse à plus tard, cliquez avec le bouton droit de la souris sur la chronologie, puis sélectionnez Définir l’intervalle du groupe de balayage sélectionné, puis Ajouter des analyses toutes les quatre heures et Pour un total de 24 heures. Réglez ensuite l’heure de démarrage sur au moins une heure après l’incubation dans l’appareil d’imagerie automatisé. Pour vérifier la progression de la croissance des sphéroïdes, tous les deux jours, connectez-vous au logiciel d’imagerie et sélectionnez Afficher les numérisations récentes. Double-cliquez sur l’expérience qui vous intéresse et sélectionnez Fond clair dans le panneau Couches d’image. Utilisez ensuite l’outil Mesurer les caractéristiques de l’image pour mesurer le diamètre des sphéroïdes. Ajout de 50 microlitres de milieu complet par puits au quatrième jour pour limiter tout milieu d’effets d’apparition.