0 vues • 4:49 min • April 30th, 2023
- Commencez par monter une larve propre et anesthésiée sous une lamelle en verre, la tête vers le haut. Ensuite, exposez la zone d’intérêt en poussant doucement la lamelle pour faire rouler la larve et ajuster sa position. Utilisez l’imagerie confocale pour localiser les cellules neurales de la larve. Identifiez un axone spécifique sur l’une des cellules neurales cibles comme site de la lésion.
Ensuite, exposez l’axone cible à un laser à deux photons à une puissance supérieure à celle utilisée pour l’imagerie afin d’induire des dommages. Un laser à deux photons est utilisé en raison de sa capacité à pénétrer et à localiser avec précision les dommages dans les tissus vivants avec des dommages minimes aux tissus environnants.
Arrêtez immédiatement l’exposition au laser lorsqu’il y a des dommages au neurone cible, entraînant une axotomie ou une section de l’axone. Enfin, imagez le neurone blessé pour voir sa dégénérescence et sa régénération ultérieure aux points temporels souhaités.
Dans l’exemple de protocole, nous allons monter une larve pour la microscopie, induire des dommages aux neurones sensoriels des larves et suivre la régénération neuronale.
- Commencez par anesthésier les larves. Dans une hotte, placez un plat en verre de 60 millimètres dans une boîte de Pétri en plastique de 15 centimètres. Pliez ensuite un morceau de papier de soie et placez-le dans le plat en verre. Placez la plaque de gélose au raisin sur le tissu après avoir ajouté l’éther diéthylique.
Ensuite, sur une lame de verre, placez une goutte d’huile d’halocarbure 27 au centre et placez un point de graisse sous vide sur chacun des quatre coins. Ensuite, à l’aide d’une pince, transférez une larve sur la plaque de gélose et couvrez le plat en verre pour anesthésier la larve. Dès que la lave cesse de bouger, transférez-la soigneusement dans l’huile d’halocarbure avec la tête droite. Placez ensuite une lamelle sur la lame et appuyez doucement dessus jusqu’à ce qu’elle touche la larve.
Ensuite, utilisez une force douce pour faire glisser la lamelle de couverture afin de faire rouler les cellules à ablater jusqu’à l’endroit où le laser à deux photons les frappera le plus facilement. L’emplacement variera en fonction des neurones ciblés. Fixez maintenant l’assemblage sur la platine du microscope à deux photons et concentrez-vous sur les cellules d’intérêt à l’aide d’un objectif à immersion dans l’huile 40x.
Dans le logiciel, passez en mode de balayage et chargez le protocole enregistré. Assurez-vous que le sténopé est complètement ouvert. Ensuite, en mode live, obtenez une bonne image de la région d’intérêt.
Ensuite, arrêtez l’analyse en direct afin que le bouton de recadrage devienne disponible. À l’aide de la fonction de recadrage, ajustez la fenêtre de balayage pour concentrer la zone cible uniquement sur le site potentiel de la blessure. Ouvrez ensuite une nouvelle fenêtre d’imagerie. Réduisez maintenant la vitesse de balayage et augmentez l’intensité du laser. Basculez ensuite le bouton continu pour démarrer et arrêter l’analyse. Regardez attentivement. Dès qu’il y a une augmentation drastique de la fluorescence, terminez le balayage.
Ensuite, revenez à la fenêtre d’imagerie d’origine et sélectionnez le mode en direct, puis recherchez la région qui vient d’être ciblée en ajustant la mise au point.
- Une bonne indication d’une blessure réussie est l’apparition d’un petit cratère, d’une structure en forme d’anneau ou de débris localisés sur le site de la blessure. Si la puissance laser était trop élevée, une grande zone endommagée serait visible, ce qui peut être mortel.
- Retirez maintenant soigneusement la lamelle et transférez la larve blessée sur une nouvelle plaque avec de la pâte de levure. Mettez l’assiette dans un plat de 60 millimètres avec un mouchoir imbibé d’acide propionique. Remettez ensuite la plaque à température de culture.
Pour l’imagerie ultérieure de la larve, utilisez la configuration confocale enregistrée et collectez des images de la pile z avec un objectif 25x. Assurez-vous d’inclure le point de normalisation afin que la régénération puisse être quantifiée.