Dépistage des modifications génomiques : une méthode pour identifier les mutants générés par CRISPR chez la drosophile

- Lorsque les embryons injectés se développent en adultes G0, croisez toutes les mouches individuelles vers des stocks d’équilibrage appropriés pour élargir les lignées potentielles modifiées par CRISPR F1 et être en mesure de suivre l’hérédité de la modification génomique. Ensuite, croisez des mâles simples F1 choisis au hasard avec des femelles équilibrées appropriées pour pouvoir récupérer la progéniture si un mâle F1 est positif pour la mutation. Une fois le croisement prélevé, transférez le mâle F1 dans un tube pour le dépistage.

Pour extraire l’ADN génomique, écrasez la mouche avec une pointe de pipette contenant un tampon d’extraction. Une fois que le tissu est décomposé, éjectez le liquide. Le tampon d’extraction contient de la protéinase K, une enzyme qui digère les protéines de l’échantillon et qui est inactivée par la chaleur élevée.

Maintenant que l’ADN est accessible, passez au dépistage par PCR. Par exemple, utilisez des amorces conçues pour amplifier une région qui inclut la nouvelle séquence. Ce n’est qu’en présence de la modification que la deuxième amorce se liera et qu’un produit PCR sera amplifié. Dans l’exemple, nous verrons des mouches être élevées et criblées