Dépistage des modifications génomiques : une méthode pour identifier les mutants générés par CRISPR chez la drosophile

- Lorsque les embryons injectés se développent en adultes G0, croisez toutes les mouches individuelles vers des stocks d’équilibrage appropriés pour élargir les lignées potentielles modifiées par CRISPR F1 et être en mesure de suivre l’hérédité de la modification génomique. Ensuite, croisez des mâles simples F1 choisis au hasard avec des femelles équilibrées appropriées pour pouvoir récupérer la progéniture si un mâle F1 est positif pour la mutation. Une fois le croisement prélevé, transférez le mâle F1 dans un tube pour le dépistage.

Pour extraire l’ADN génomique, écrasez la mouche avec une pointe de pipette contenant un tampon d’extraction. Une fois que le tissu est décomposé, éjectez le liquide. Le tampon d’extraction contient de la protéinase K, une enzyme qui digère les protéines de l’échantillon et qui est inactivée par la chaleur élevée.

Maintenant que l’ADN est accessible, passez au dépistage par PCR. Par exemple, utilisez des amorces conçues pour amplifier une région qui inclut la nouvelle séquence. Ce n’est qu’en présence de la modification que la deuxième amorce se liera et qu’un produit PCR sera amplifié. Dans l’exemple, nous verrons des mouches être élevées et criblées par PCR pour l’insertion d’une séquence de transactivation remplaçant le premier exon du gène sans branche.

- Lorsque des embryons nos-Cas9 précédemment injectés avec le plasmide d’expression de l’ARN guide et le donneur de remplacement deviennent adultes, croisez des mouches G0 individuellement avec des mouches équilibrantes d’une lignée appropriée pour l’allèle ciblé. Anesthésiez la progéniture F1 de chaque croisement G0 sur un tampon de dioxyde de carbone et choisissez au hasard 10 à 20 mâles au microscope stéréoscopique. Croisez individuellement chaque mâle sélectionné avec une femelle équilibrante à partir d’une lignée appropriée pour l’allèle ciblé.

Lorsque les larves F2 éclosent, choisissez le père F1 de chaque croisement. Extrayez l’ADN génomique en écrasant chaque mouche pendant 10 à 15 secondes avec une pointe de pipette contenant 50 microlitres de tampon d’écrasement sans distribuer le tampon. Ensuite, versez le tampon restant dans le tube et mélangez bien.

Incuber à 37 degrés Celsius pendant 20 à 30 minutes. Après l’incubation, placez les tubes dans un bloc de chaleur à 95 degrés Celsius pendant 1 à 2 minutes pour inactiver la protéinase K. Après avoir tourné pendant 5 minutes à 10 000 fois g, conservez la préparation à 4 degrés Celsius pour une analyse PCR plus approfondie.

Effectuez des tests PCR en trois étapes à l’aide des amorces avant 1 et arrière 1 pour dépister l’existence de l’insertion ou du remplacement. Effectuez une PCR à l’aide d’amorces avant 2 et arrière 2 pour vérifier l’insertion ou le remplacement à partir de trois régions principales. Effectuez une PCR à l’aide des amorces M13F et inversez 3 pour vérifier les extrémités HDR.

- Conservez les lignes de mouche avec le HDR d’extrémités confirmées et établissez des stocks équilibrés à partir de la génération F2. Croisez à nouveau les mouches d’équilibrage pour éliminer toute mutation involontaire sur d’autres chromosomes.