0 vues • 3:08 min • April 30th, 2023
- Pour immobiliser les mouches pour l’enrobage de paraffine, poussez soigneusement les drosophiles anesthésiées à travers l’espace d’un collier anti-mouches afin que leur tête soit uniformément positionnée sur le dessus de l’appareil tout en restant attachée au reste du corps. Pour la fixation des tissus, placez les colliers dans la solution de Carnoy. Le Carnoy est un agent de fixation dénaturant composé d’éthanol, de chloroforme et d’acide acétique.
Pour préparer l’échantillon à l’infiltration de paraffine, déshydratez le tissu en transférant le collier à travers des concentrations graduées d’éthanol. Ensuite, transférez le collier sur du benzoate de méthyle, un solvant organique. Ensuite, placez-le dans une solution de benzoate de méthyle et de paraffine fondue pendant qu’il est chauffé pour vous assurer que la paraffine reste fondue. Procédez à une série élaborée d’étapes de lavage avec de la paraffine préchauffée seule pour éliminer le benzoate de méthyle.
Ensuite, placez rapidement le collier dans un moule et versez de la paraffine fondue pour le recouvrir complètement. Une fois que la paraffine a durci, retirez le bloc du moule et utilisez une lame de rasoir pour couper l’excès de paraffine. Cassez le collier en laissant la rangée de têtes encastrées dans le bloc de paraffine. Dans l’exemple de protocole, nous verrons la procédure démontrée pour l’analyse des phénotypes neurodégénératifs.
- Pour commencer, utilisez d’abord une pince pour enfiler les mouches du sujet par le cou dans les colliers. Alignez toutes les têtes dans la même orientation et assurez-vous qu’aucun dommage ne se produit à la tête ou aux yeux. Incluez des mouches sinusoïdales sans yeux à des positions aléatoires connues afin que l’ordre des mouches puisse être facilement identifié dans les sections. De plus, si la souche de mouche d’intérêt a les yeux clairs ou blancs, enfilez des mouches aux yeux rouges à intervalles réguliers le long de la bande pour vous assurer qu’il y a suffisamment de pigment pour colorer la lame.
Notez l’ordre des mouches ainsi que le numéro du collier s’il y en a plusieurs. Une fois qu’un collier est terminé, placez-le dans la solution de Carnoy pendant 3,5 à 4 heures. Effectuez une série de lavages à l’éthanol, au benzoate de méthyle et à la paraffine pour préparer le tissu de la mouche à l’enrobage. Ensuite, placez les colliers dans un bac à glaçons en caoutchouc, un par section.
Versez doucement de la paraffine fondue sur les colliers en évitant les bulles d’air et laissez-la durcir pendant la nuit. Retirez les blocs de paraffine contenant les colliers du plateau. Séparez le bloc de paraffine du collier à l’aide d’une lame de rasoir, en cassant doucement le collier. Les corps resteront dans le collier tandis que les têtes resteront dans le bloc de paraffine.