Injection de mouches drosophiles adultes : méthode d’administration d’un composé ou d’une étiquette
JoVE Encyclopedia of Experiments
Biologie
0 vues • 3:23 min • April 30th, 2023
- Préparez les aiguilles d’injection coniques en tirant sur les capillaires en verre à paroi mince à l’aide d’un extracteur d’aiguille. Tenez une aiguille sous un microscope et cassez la pointe, en vous assurant que l’ouverture est juste assez grande pour percer la cuticule de la mouche adulte sans la blesser plus que nécessaire. Mesurez le volume d’injection en chargeant votre aiguille d’une solution stérile de colorant et de tampon salin, puis en l’éjectant sur une goutte d’huile minérale sur un micromètre platinal. Utilisez l’échelle du micromètre pour mesurer le diamètre de la gouttelette éjectée, qui peut être utilisée pour calculer le volume distribué, et calibrez les paramètres de votre injecteur en conséquence.
Chargez l’aiguille avec votre solution d’injection et montez-la sur une buse d’injection. Anesthésiez vos mouches avec du CO2 et disposez-les sur un coussin anti-mouches au CO2 qui les maintiendra anesthésiées. Une fois que les mouches sont dans la bonne orientation pour votre expérience, procédez aux injections. Dans l’exemple de protocole, nous injecterons des mouches adultes avec des particules marquées à la fluorescéine pour l’imagerie in vivo.
- Après avoir tiré des capillaires en verre à paroi mince avec un extracteur d’aiguille, utilisez un micromètre pour tenir l’aiguille sous un microscope et utilisez une pince à épiler en acier inoxydable à pointe fine numéro cinq pour casser la pointe à un diamètre de pointe de 100 micromètres. Pour mesurer le volume de liquide qui sera injecté dans chaque mouche, chargez une aiguille capillaire avec un colorant alimentaire stérile à 5 % dans du PBS et expulsez le liquide sur une goutte d’huile minérale sur un micromètre à étape de 0,01 millimètre.
Versez 10 microlitres de particules de 1,6 milligramme par millilitre sur un petit carré de parafilm et tirez le liquide dans l’aiguille. Montez l’aiguille dans la buse de l’injecteur et alignez les mouches anesthésiées le long de leur zone désignée sur le coussin anti-mouches, côté ventral vers le haut, avec les têtes orientées vers l’avant du tampon. Placez les flacons dans les zones correspondantes sur la paillasse et injectez les mouches dans le coin supérieur de l’abdomen avec cinq pompes de liquide de 100 millisecondes pour délivrer environ 10 nanolitres de particules au total. Transférez chaque mouche dans le flacon approprié au fur et à mesure de l’injection, en notant le temps sur le flacon.
Ensuite, chargez une nouvelle aiguille avec une solution de Trypan Blue à 0,4 % et réglez l’injecteur pneumatique sur « gate » pour permettre à un flux d’air constant de pousser le liquide hors de l’aiguille. 30 minutes après l’injection initiale, injectez chaque abdomen de mouche avec Trypan Blue jusqu’à ce que les abdomens soient pleins et distendus. Montez les mouches sur des lames de microscope avec du ruban électrique côté ventral vers le bas, en poussant les ailes sur le côté de la mouche pour les fixer au ruban. Ensuite, enfoncez doucement la tête dans le ruban adhésif pour vous assurer que la mouche ne bougera pas.
Aperçu
Cet article décrit un protocole d'injection de particules marquées à la fluorescéine chez des mouches adultes pour l'imagerie in vivo. La méthode consiste à préparer des aiguilles d'injection effilées et à anesthésier les mouches afin de faciliter des injections précises.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Neurosciences
- Biologie
- Imagerie in vivo
Contexte
- Les techniques d'injection sont essentielles pour l'étude des processus biologiques chez les organismes modèles.
- Les particules marquées à la fluorescéine permettent la visualisation des matériaux injectés.
- La préparation et l'étalonnage adéquats des aiguilles sont essentiels pour une administration précise des doses.
- L'anesthésie au CO2 est couramment utilisée pour immobiliser les mouches pendant les interventions.
Objectif de l'étude
- Démontrer une méthode fiable pour injecter des substances dans des mouches adultes.
- Faciliter l'imagerie in vivo de processus biologiques à l'aide de marqueurs fluorescents.
- Fournir un protocole détaillé aux chercheurs du domaine.
Méthodes utilisées
- Préparation d'aiguilles d'injection effilées à l'aide d'un tireur d'aiguilles.
- Étalonnage du volume d'injection à l'aide d'un micromètre et d'un colorant stérile.
- Anesthésie des mouches au CO2 et disposition sur un coussin à mouches.
- Injection de particules marquées à la fluorescéine et imagerie ultérieure.
Résultats principaux
- Injection réussie de particules dans l'abdomen de mouches adultes.
- Visualisation des matériaux injectés à l'aide de techniques d'imagerie in vivo.
- Démonstration de l'efficacité du protocole d'injection.
- Mise en place d'une méthode pour des études futures impliquant des techniques similaires.
Conclusions
- Le protocole fournit une méthode fiable pour injecter des substances dans des mouches.
- L'imagerie in vivo peut être efficacement réalisée à l'aide de particules marquées à la fluorescéine.
- Cette technique peut être adaptée à divers besoins expérimentaux en neurosciences et en biologie.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle pour l'industrie
Une administration précise des composés chez les organismes modèles permet de réduire les risques mécanistiques liés aux cibles thérapeutiques et soutient le développement précoce des tests. Cette méthode offre une approche évolutible pour introduire des composés marqués ou des produits biologiques chez la drosophile adulte, facilitant les criblages phénotypiques et les procédures de validation des cibles. En standardisant le volume d'injection et en minimisant les lésions tissulaires, elle améliore la reproductibilité des flux de travail en biologie de la découverte.
Applications stratégiques en recherche et développement biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Valeur scientifique : Permet l'interrogation d'hypothèses thérapeutiques grâce à l'administration contrôlée de composés ou de marqueurs vers des tissus spécifiques.
- Valeur opérationnelle : Facilite la validation fonctionnelle des cibles en permettant une évaluation directe de l'absorption et de la distribution des composés in vivo.
- Valeur prédictive : Renforce la fiabilité des données sur l'engagement de la cible en réduisant la variabilité liée à un dosage inconstant.
Développement de tests et criblage
- Prêt de l'essai : Prépare des systèmes biologiques validés pour des applications de détection et d'imagerie basées sur la fluorescence.
- Production quantitative : Permet une administration normalisée des composés, soutenant des campagnes de criblage reproductibles.
- Extensibilité : Facilite la réutilisation de la plateforme pour plusieurs cibles ou séries de composés grâce à des paramètres de calibration et d'injection d'aiguille constants.
Recherche translationnelle et préclinique
- Pertinence pour les maladies : Soutient l'utilisation de Drosophila comme système pertinent pour l'étude de voies conservées et de mécanismes cibles dans les maladies.
- Continuité translationnelle : Établit un lien entre les découvertes et la validation préclinique en permettant des modèles d'exposition aux composés cohérents.
- Décisions ajustées au risque : Éclaire les critères de poursuite ou d'abandon grâce à une mesure fiable de l'administration et de la biodisponibilité des composés.
Intégration des pipelines et des flux de travail
Cette méthode s'inscrit dans le continuum de la découverte, allant du test d'hypothèses sur une cible à l'identification d'un composé précurseur, en particulier lorsque la localisation du composé ou la modulation de la cible doit être visualisée in vivo.
- Biologie de la découverte : Permet de tester des hypothèses en assurant une délivrance précise de sondes ou de composés afin d'évaluer l'activité de la voie ciblée.
- Criblage : Améliore la reproductibilité des tests grâce à des volumes d'injection calibrés et à des protocoles de délivrance standardisés.
- Analytique : Génère des lectures d'imagerie quantitatives permettant de comparer la distribution des composés et l'engagement de la cible selon différentes conditions.
- Recherche translationnelle : Établit un lien entre la validation précoce de la cible et la continuité préclinique en modélisant l'exposition aux composés dans un contexte d'organisme entier.
- Réutilisation en entreprise : Constitue une capacité réutilisable pour de multiples projets nécessitant une délivrance in vivo de composés chez Drosophila.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance prédictive dans la validation des cibles en réduisant l'ambiguïté mécanistique liée à l'exposition variable aux composés.
- Valeur opérationnelle : Améliore la standardisation et la reproductibilité entre laboratoires grâce à l'étalonnage des aiguilles et au contrôle des paramètres d'injection.
- Valeur stratégique : Permet de prendre des décisions plus éclairées quant à la poursuite ou l'abandon de projets en fournissant des données fiables sur l'administration des composés, réduisant ainsi les risques biologiques en phase avancée.
- Impact sur le portefeuille : Permet une priorisation ajustée au risque des cibles fondée sur des preuves cohérentes de délivrance in vivo et de modulation de la cible.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en microchirurgie et en microscopie pour la préparation des aiguilles et la manipulation des mouches.
- Dépend de l'accès à un tireur d'aiguilles, à un micromètre et à un injecteur pneumatique pour l'étalonnage du volume.
- Exige une standardisation de l'anesthésie et du moment des injections entre les équipes afin d'obtenir des résultats reproductibles.
- Implique des ajustements à prendre en compte lors de l'application à différentes souches de mouches, à différents âges ou à des composés de viscosités variées.
- Est limité par les contraintes physiques liées à la taille des mouches et au volume d'injection, ce qui peut restreindre la capacité de charge en composé.
F.A.Q. sur la bio-industrie pharmaceutique
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Dernière mise à jour : 29 août 2026