JoVE Encyclopedia of Experiments
Biologie
0 vues • 4:20 min • April 30th, 2023
- La glande lymphatique larvaire de Drosophila melanogaster est responsable de la production d’hémocytes, ou cellules sanguines, qui circulent dans l’hémolymphe larvaire. Pour identifier la glande lymphatique, trouvez d’abord le vaisseau dorsal, ou cœur, qui pompe l’hémolymphe dans tout le corps. Suivez le vaisseau dorsal vers la tête jusqu’à ce que vous trouviez le cerveau. La glande lymphatique est une petite structure multilobée située à côté du cerveau, flanquant le vaisseau dorsal.
Pour trouver le lobe primaire, identifiez le plus grand lobe de la glande. Ce lobe contient trois zones, définies par différents stades de développement des hémocytes. La zone médullaire la plus proche du vaisseau dorsal contient des hémocytes immatures, tandis que la zone corticale contient des hémocytes matures. À l’extrémité postérieure du lobe primaire, vous pouvez trouver le centre de signalisation postérieur, composé d’hémocytes spécialisés. Les lobes secondaire et tertiaire sont plus petits et n’ont pas de zones définies.
Pour disséquer la glande lymphatique, vous aurez besoin d’un microscope à dissection, de deux pinces pour manipuler les larves et d’une solution saline tamponnée.
Dans cet exemple, nous allons disséquer des ganglions lymphatiques pour les utiliser en immunohistochimie.
- Pour commencer le curage ganglionnaire, ajoutez 1 millilitre de 1x PBS à 1 puits d’une plaque de 24 puits pour chaque cadre expérimental à disséquer. Ensuite, à l’aide d’une pipette de transfert jetable, ajoutez 1 goutte de PBST à 0,1 % dans chaque puits. Placez l’assiette à plat sur de la glace. Placez un tampon de dissection propre sur une base de stéréomicroscope éclairée. À l’aide d’une pipette de transfert jetable, placez une goutte de PBST à 0,01 % sur le tampon.
Transférez une larve dans la goutte PBST pour la dissection. Tenez la lave avec une paire de pinces, côté dorsal vers le haut, à environ 1/4 de longueur de l’extrémité postérieure. Avec la deuxième paire de pinces, saisissez la cuticule immédiatement avant la première paire et tirez doucement la cuticule larvaire vers l’avant, jusqu’à ce que les crochets buccaux soient exposés.
Relâchez la cuticule et utilisez les deux pinces pour couper la larve en deux. Retirez l’extrémité postérieure de la goutte PBST et jetez-la. Fixez la cuticule pour plus de stabilité, puis utilisez la deuxième paire de pinces pour saisir les crochets buccaux exposés et retirez-les doucement. Cela séparera la cuticule des structures internes.
En gardant les crochets buccaux, retirez soigneusement les structures indésirables, telles que les glandes salivaires, le corps adipeux et l’intestin. Ramassez doucement le complexe de tissus disséqués par les crochets buccaux et transférez-le dans un puits de la plaque sur de la glace. Répétez la dissection avec autant de larves que vous le souhaitez, mais ne dépassez pas un temps de dissection de 30 minutes avant de passer à l’étape de fixation.
Pour commencer le montage des tissus, placez une goutte de tampon de montage sur une lame de verre. À l’aide des crochets buccaux comme poignée, transférez la glande lymphatique dans la gouttelette tampon. Espacez uniformément les tissus, en répartissant le tampon de montage dans le processus.
Glissez délicatement une pince de la pince sous le vaisseau dorsal, en tirant doucement vers la périphérie du tampon de montage pour extraire et aplatir la glande lymphatique. Avec un mouvement de sciage, coupez le vaisseau dorsal entre la glande lymphatique et le cerveau. Éloignez le reste des tissus de la glande lymphatique vers le bord le plus externe du tampon.
Prenez une lamelle propre et abaissez-la soigneusement sur le tampon de montage. Les lames sont maintenant prêtes pour l’imagerie ou peuvent être stockées à 4 degrés Celsius jusqu’à ce que vous en ayez besoin.