0 vues • 3:55 min • April 30th, 2023
- Tout d’abord, collectez les mouches au stade de développement souhaité et placez-les dans un tube stérile. Pour ne compter que le microbiote interne, stérilisez l’extérieur des mouches en les immergeant dans de l’éthanol à 70 %. Pour mesurer à la fois le microbiote interne et externe, sautez cette étape de stérilisation. Ensuite, broyez les mouches dans un petit volume de milieu de croissance bactérienne à l’aide de billes de céramique et d’un homogénéisateur de tissus, ou manuellement avec un pilon. Il faut veiller à ne pas introduire de bactéries provenant de sources externes, afin d’éviter de contaminer les échantillons.
Vous devriez maintenant avoir un mélange homogène contenant des bactéries que vous pouvez cultiver. Augmentez le volume de l’homogénat à l’aide d’un milieu bactérien liquide. Effectuez des dilutions en série de l’homogénat et plaquez un volume constant de ces dilutions sur le milieu de croissance solide approprié pour vos bactéries. Au fur et à mesure que les bactéries se développent, des colonies se forment sur l’assiette. Trouvez la dilution qui a une plage de 10 à 100 colonies pour déterminer les unités formant colonies, ou UFC, de l’échantillon.
Dans l’exemple de protocole, nous inoculerons des mouches stériles avec un gnotobiotique ou une culture bactérienne définie et collecterons et mesurerons les UFC.
- Utilisez des embouts filtrants pour transférer 100 microlitres de croissance pendant la nuit dans un tube de microfuge stérile. Ensuite, transférez 200 microlitres de chaque culture dans une plaque à 96 puits. Retirez les échantillons de l’enceinte de biosécurité et centrifugez-les pour granuler les bactéries. Après avoir effectué des dilutions une, deux et quatre, mesurez la densité optique ou OD600 sur un spectrophotomètre à lecture de plaques multipuits.
Après avoir obtenu l’OD600, retirez le surnageant à l’aide d’une pointe de pipette et utilisez de l’ARMm frais pour remettre la pastille en suspension. Mélangez les souches bactériennes diluées dans des proportions égales pour créer un cocktail multi-espèces. Transférez 50 microlitres du cocktail dans les tubes coniques contenant le régime stérile et les œufs déchotionnés. Assurez-vous d’ajouter les bactéries après le transfert des œufs pour éviter la contamination entre les flacons. Placez ensuite les tubes inoculés dans un incubateur.
Pour mesurer les unités formant colonie ou UFC, transférez cinq mouches dans un tube de microfuge de 1,7 millilitre contenant 125 microlitres de billes de céramique et 125 microlitres de bouillon MRSM. Homogénéisez les mouches à l’aide d’un homogénéisateur de tissus. Il ne doit pas y avoir de morceaux entiers restants de la mouche. Ensuite, diluez l’homogénat avec 875 microlitres de mMRS, faites tourbillonner l’homogénat pendant cinq secondes et pipetez 120 microlitres dans le premier puits d’une plaque de microtitration.
Retirez 10 microlitres du premier puits et ajoutez-les dans le deuxième puits contenant 70 microlitres de MRS. Mélangez soigneusement le contenu du deuxième puits. Transférez ensuite 10 microlitres du deuxième puits au troisième puits contenant 70 microlitres de MRS, et mélangez soigneusement. Transférez 10 microlitres de chaque dilution dans une plaque mMRS. Inclinez légèrement le plat pour étaler la dilution sur plusieurs millimètres à la surface de l’agar-agar et laissez le liquide sécher avant de déplacer la plaque. Retirez les plaques de l’incubateur une fois que des colonies individuelles distinctes sont visibles et comptez-les à partir d’une dilution avec 10 à 100 colonies isolées. Enfin, calculez l’UFC par mouche.