Traitement de pattes d’insectes pour la microscopie à fluorescence : une méthode pour préserver les structures neuromusculaires pour l’imagerie

- Pour commencer, immergez les insectes anesthésiés dans une solution d’éthanol à 70 % pour réduire l’hydrophobicité de la cuticule. Ensuite, lavez et perméabilisez le tissu avec une solution saline tamponnée au phosphate contenant un détergent pendant au moins 30 minutes pour permettre la pénétration des tissus pendant la fixation.

Ensuite, retirez la tête et l’abdomen du thorax. Utilisez une pince pour appliquer une légère pression sur la jonction coxa-thorax et détachez la jambe. Placez soigneusement les cuisses dans une solution glacée de paraformaldéhyde à 4 % pendant la nuit pour lui permettre de pénétrer dans les tissus. Le paraformaldéhyde fixe les tissus en réticulant les protéines.

Ensuite, retirez la solution de fixation et lavez le tissu plusieurs fois avec un détergent contenant une solution saline tamponnée au phosphate. Avant le montage, placez les pattes dans un tampon de montage pur ou légèrement dilué pendant au moins une journée pour laisser suffisamment de temps au tampon pour pénétrer dans les tissus.

Enfin, montez les pieds dans une goutte de support de montage. Utilisez une entretoise entre la lame du microscope et la lamelle pour éviter d’endommager l’échantillon, et fixez la monture avec du vernis à ongles.

Dans l’exemple suivant, nous verrons la dissection, la fixation et le montage des pattes de Drosophila melanogaster.

- Commencez par remplir le nombre approprié de puits dans une plaque multipuits en verre avec de l’éthanol à 70 %. Utilisez une brosse pour ajouter 15 à 20 mouches anesthésiées au dioxyde de carbone de tout âge ou sexe dans chaque puits, et tamponnez doucement les mouches dans l’éthanol jusqu’à ce qu’elles soient complètement immergées.

Après pas plus d’une minute, rincez les mouches trois fois avec une solution détergente tensioactive non ionique à 0,3 % dans une solution saline tamponnée au phosphate pendant au moins 10 minutes par lavage. Après le dernier lavage, utilisez une pince pour retirer la tête et l’abdomen de chaque mouche sans endommager le segment thoracique ou les pattes, et utilisez la pointe d’une paire de pinces fines pour appliquer doucement mais fermement une pression sur la jonction coxa-thorax pour détacher une patte du segment thoracique.

Placez les cuisses dans un puits d’une nouvelle assiette multipuits, contenant 4 % de paraformaldéhyde fraîchement préparé sur de la glace, pour une incubation d’une nuit à 4 degrés Celsius.

- Il est important de pousser doucement les jambes dans le tampon de fixation sans les laisser flotter pour obtenir des jambes bien fixées.

- Le lendemain, lavez les cuisses cinq fois dans une solution détergente surfactante non ionique fraîche à 0,3 % pendant 20 minutes par lavage. Après le dernier lavage, remplacez le détergent par le support de montage et maintenez les pieds dans le support de montage pendant au moins 24 heures.

Le lendemain, ajoutez environ 20 microlitres de glycérol à 70 % à côté de l’extrémité recouverte de la lame de microscope en verre et couvrez le glycérol avec une lamelle de 22 x 22 millimètres. Ensuite, ajoutez une ligne d’environ 10 microlitres de support de montage à droite de la lamelle et appliquez une deuxième ligne de 30 microlitres de support de montage à droite de la ligne de 10 microlitres.

À l’aide d’une pince fine, transférez une jambe de la plaque multipuits dans une goutte de fluide vers la bande de 10 microlitres de support de montage dans une orientation externe vers le haut ou vers le bas. Répétez l’opération jusqu’à ce que six à huit pattes aient été montées et alignées, et placez une deuxième lamelle sur les pattes de sorte que la deuxième lamelle repose légèrement sur la première lamelle. Ensuite, utilisez du vernis à ongles à chaque coin des lamelles pour les fixer en place.