0 vues • 2:56 min • April 30th, 2023
- Transférez C. elegans lavé dans un liquide sur une lame de verre préalablement recouverte de polylysine, un composé qui aidera les cuticules des vers à adhérer à la surface du verre. Appuyez doucement sur une autre lame de verre vers le bas avec un bord surplombant la glissière inférieure. Pour immobiliser les vers sans les endommager, comprimez les animaux en évitant tout mouvement latéral. Ensuite, placez les lames de verre avec des vers en sandwich sur un bloc métallique à l’intérieur d’un récipient de laboratoire isolé rempli d’un agent de congélation, tel que de l’azote liquide ou de la glace sèche.
Le métal est un conducteur de température efficace, garantissant que la surface du bloc est suffisamment froide pour geler rapidement les cuticules du ver sur les deux surfaces vitrées. Une fois congelés, séparez rapidement les lames de verre pour séparer ou ouvrir les cuticules du ver. Procéder à la fixation et à la coloration des tissus, car la perturbation de la cuticule à faible perméabilité permet aux fixateurs chimiques et aux anticorps de coloration d’accéder aux tissus intérieurs des vers. Dans le protocole suivant, nous verrons une démonstration détaillée de la technique de fissuration par congélation et de la fixation des tissus.
- Tout d’abord, préparez une diapositive pour réparer les vers. Pipetez 30 microlitres de poly-L-lysine sur une lame, puis placez une deuxième lame sur l’autre et frottez-les ensemble pour répartir uniformément la solution sur les deux. Maintenant, séparez les deux lames et laissez-les sécher à l’air libre pendant 30 minutes.
Ensuite, placez un bloc métallique plat dans un récipient rempli d’azote liquide. Lavez les plaques avec la solution M9 et transférez environ 10 microlitres de M9 contenant les vers. Vous pouvez également choisir les vers et ajouter M9 à la diapositive.
Une fois les vers transférés, déposez doucement une lamelle transversale sur eux de sorte que la lamelle surplombe un bord. Ensuite, appuyez doucement sur la lamelle sans faire de mouvements latéraux.
Maintenant, transférez immédiatement la lame sur le bloc métallique dans de l’azote liquide et laissez-la geler. Au bout de cinq minutes, retirez la lamelle à l’aide du bord en surplomb. Faites-le rapidement pour obtenir la bonne fissure de la cuticule.
Ensuite, plongez la lame dans un bocal Coplin en verre rempli de méthanol à moins 20 degrés Celsius. Après cinq minutes, transférez la lame dans un bocal en verre Coplin rempli d’acétone pendant encore cinq minutes à la même température. Les lames peuvent être teintées directement ou stockées à moins 20 degrés Celsius.