PCR à ver unique : une méthode pour extraire et amplifier l’ADN génomique

- Pour l’analyse PCR d’un seul ver, laissez un ver hermaphrodite s’autoféconder et pondre des œufs qui produiront une progéniture génétiquement identique et, par conséquent, préserveront une copie de la souche modifiée. Ensuite, transférez le parent dans un tube contenant un tampon de lyse des vers.

Congelez le tube à moins 80 degrés Celsius pour ouvrir la cuticule ou la couche externe. Chauffez l’échantillon à plus de 60 degrés Celsius pour lyser les cellules du ver en libérant les protéines intracellulaires ainsi que l’ADN génomique de la cellule. À cette température, la protéinase K contenue dans le tampon dégrade les protéines, en particulier les nucléases qui détruiraient autrement l’ADN génomique.

Ensuite, augmentez la température à 95 degrés Celsius pour inactiver l’enzyme. Enfin, ajoutez le lysat cellulaire dans un tube avec un mélange maître PCR composé d’un tampon de réaction, de dNTP, d’amorces directes et inverses pour la région d’intérêt, de taq polymérase et d’eau pour amener la réaction au volume final souhaité. Pour effectuer la PCR, exécutez le programme de thermocycleur approprié qui amplifie la région d’intérêt de l’ADN.

Dans l’exemple suivant, nous verrons une p