Coloration rouge du Nil de C. elegans : une méthode pour visualiser les gouttelettes lipidiques chez les animaux fixes

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Biologie

0 vues • 3:34 min • April 30th, 2023

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- Lors de la visualisation de gouttelettes lipidiques, les organites de stockage intracellulaires des lipides neutres, commencent par ajouter une solution détergente, telle que celle contenant du Triton X-100, à l’échantillon. Cela permettra de perméabiliser les cellules du ver. Ensuite, fixez l’échantillon à la concentration appropriée d’isopropanol, par exemple 40 %.

Ensuite, ajoutez Nile Red à l’échantillon et protégez-le de la lumière, car le colorant est sensible à la lumière. La fixation permet au colorant d’accéder aux gouttelettes lipidiques dans tout l’animal. Nile Red est un colorant lipophile dont le spectre d’émission de fluorescence dépend de la polarité de l’environnement lipidique local.

Lorsqu’il est exposé à des lipides polaires, tels que les phospholipides, le spectre d’émission du rouge du Nil se situe dans les longueurs d’onde rouges supérieures. Lorsqu’il est exposé à des lipides neutres, tels que les triacylglycérols et les esters de stérols dans le noyau neutre des gouttelettes lipidiques, le spectre d’émission du rouge du Nil se déplace vers les longueurs d’onde inférieures, jaune-or.

Par conséquent, utilisez le canal vert d’un microscope fluorescent, qui collectera les émissions de longueur d’onde jaune-or, pour visualiser la coloration rouge du Nil des gouttelettes lipidiques dans tout l’animal. Dans l’exemple de protocole, nous verrons une procédure de coloration au rouge du Nil et une imagerie de gouttelettes lipidiques dans des échantillons fixes.

- Pour effectuer la coloration lipidique du rouge du Nil, placez les vers sur un milieu de croissance de nématodes, ou NGM, ensemencés avec du log tardif OP50 E. coli, et faites pousser les vers à 20 degrés Celsius jusqu’au stade L4 précoce. Lavez les vers avec 1 millilitre de solution PBST et transférez la suspension de vers dans un tube de microfuge de 1,5 millilitre.

Centrifugez les vers à 560 fois la gravité pendant une minute, puis retirez le surnageant et répétez le lavage PBST jusqu’à ce que E. coli soit éliminé de la suspension. Ensuite, à la pastille de ver, ajoutez 100 microlitres d’isopropanol à 40 %, ou 60 % pour la coloration ORO, et incubez l’échantillon à température ambiante pendant trois minutes.

- L’ajout d’isopropanol est crucial pour une bonne perméabilisation des vers avant la coloration.

- Centrifugez les vers à 560 fois la gravité pendant une minute et retirez le surnageant sans perturber la pastille de ver.

- Il est important de minimiser l’exposition à la lumière pendant les étapes de centrifugation.

- Maintenant, dans l’obscurité, ajoutez 600 microlitres de solution de travail NR préalablement préparée à chaque échantillon. Retournez les tubes trois fois et mélangez complètement les vers et la solution. Ensuite, incubez l’échantillon dans l’obscurité à température ambiante pendant deux heures.

Après l’incubation, centrifugez les vers et retirez le surnageant. Ajoutez ensuite 600 microlitres de PBST et incubez les échantillons dans l’obscurité pendant 30 minutes pour éliminer l’excès de coloration NR. Après avoir fait tourner les échantillons à nouveau comme précédemment, retirez tous les microlitres de surnageant, à l’exception d’environ 50 microlitres.

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Dernière mise à jour : 1 août 2026