Coloration rouge du Nil de C. elegans : une méthode pour visualiser les gouttelettes lipidiques chez les animaux fixes
JoVE Encyclopedia of Experiments
Biologie
0 vues • 3:34 min • April 30th, 2023
- Lors de la visualisation de gouttelettes lipidiques, les organites de stockage intracellulaires des lipides neutres, commencent par ajouter une solution détergente, telle que celle contenant du Triton X-100, à l’échantillon. Cela permettra de perméabiliser les cellules du ver. Ensuite, fixez l’échantillon à la concentration appropriée d’isopropanol, par exemple 40 %.
Ensuite, ajoutez Nile Red à l’échantillon et protégez-le de la lumière, car le colorant est sensible à la lumière. La fixation permet au colorant d’accéder aux gouttelettes lipidiques dans tout l’animal. Nile Red est un colorant lipophile dont le spectre d’émission de fluorescence dépend de la polarité de l’environnement lipidique local.
Lorsqu’il est exposé à des lipides polaires, tels que les phospholipides, le spectre d’émission du rouge du Nil se situe dans les longueurs d’onde rouges supérieures. Lorsqu’il est exposé à des lipides neutres, tels que les triacylglycérols et les esters de stérols dans le noyau neutre des gouttelettes lipidiques, le spectre d’émission du rouge du Nil se déplace vers les longueurs d’onde inférieures, jaune-or.
Par conséquent, utilisez le canal vert d’un microscope fluorescent, qui collectera les émissions de longueur d’onde jaune-or, pour visualiser la coloration rouge du Nil des gouttelettes lipidiques dans tout l’animal. Dans l’exemple de protocole, nous verrons une procédure de coloration au rouge du Nil et une imagerie de gouttelettes lipidiques dans des échantillons fixes.
- Pour effectuer la coloration lipidique du rouge du Nil, placez les vers sur un milieu de croissance de nématodes, ou NGM, ensemencés avec du log tardif OP50 E. coli, et faites pousser les vers à 20 degrés Celsius jusqu’au stade L4 précoce. Lavez les vers avec 1 millilitre de solution PBST et transférez la suspension de vers dans un tube de microfuge de 1,5 millilitre.
Centrifugez les vers à 560 fois la gravité pendant une minute, puis retirez le surnageant et répétez le lavage PBST jusqu’à ce que E. coli soit éliminé de la suspension. Ensuite, à la pastille de ver, ajoutez 100 microlitres d’isopropanol à 40 %, ou 60 % pour la coloration ORO, et incubez l’échantillon à température ambiante pendant trois minutes.
- L’ajout d’isopropanol est crucial pour une bonne perméabilisation des vers avant la coloration.
- Centrifugez les vers à 560 fois la gravité pendant une minute et retirez le surnageant sans perturber la pastille de ver.
- Il est important de minimiser l’exposition à la lumière pendant les étapes de centrifugation.
- Maintenant, dans l’obscurité, ajoutez 600 microlitres de solution de travail NR préalablement préparée à chaque échantillon. Retournez les tubes trois fois et mélangez complètement les vers et la solution. Ensuite, incubez l’échantillon dans l’obscurité à température ambiante pendant deux heures.
Après l’incubation, centrifugez les vers et retirez le surnageant. Ajoutez ensuite 600 microlitres de PBST et incubez les échantillons dans l’obscurité pendant 30 minutes pour éliminer l’excès de coloration NR. Après avoir fait tourner les échantillons à nouveau comme précédemment, retirez tous les microlitres de surnageant, à l’exception d’environ 50 microlitres.
Aperçu
Cet article décrit un protocole permettant de visualiser les gouttelettes lipidiques chez les nématodes à l'aide de la coloration au Rouge Nil. La méthode consiste à rendre les cellules perméables, à fixer les échantillons, puis à observer les gouttelettes lipidiques par microscopie de fluorescence.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Neurosciences
- Biologie cellulaire
- Biochimie
Contexte
- Les gouttelettes lipidiques sont des organites intracellulaires de stockage des lipides neutres.
- Le Rouge Nil est un colorant lipophile utilisé pour la coloration des lipides.
- La fluorescence du colorant varie selon l'environnement lipidique.
- Une fixation et une perméabilisation adéquates sont cruciales pour une coloration efficace.
Objectif de l'étude
- Visualiser les gouttelettes lipidiques chez les nématodes.
- Démontrer l'utilisation du Rouge Nil pour la coloration des lipides.
- Fournir un protocole détaillé aux chercheurs.
Méthodes utilisées
- Préparation des nématodes sur milieu de croissance.
- Lavage et centrifugation des échantillons de vers.
- Fixation à l'isopropanol pour la perméabilisation.
- Marquage avec le rouge Nil et imagerie ultérieure.
Résultats principaux
- Visualisation réussie des gouttelettes lipidiques par microscopie de fluorescence.
- Mise en évidence des changements du spectre d'émission du rouge Nil en fonction du type de lipide.
- Efficacité du protocole confirmée par des résultats reproductibles.
- Importance de minimiser l'exposition à la lumière pendant le protocole soulignée.
Conclusions
- Le rouge Nil est un outil efficace pour la visualisation des gouttelettes lipidiques.
- Une préparation adéquate des échantillons est essentielle pour obtenir des résultats précis.
- Ce protocole peut contribuer à de nouvelles études sur le métabolisme des lipides.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle pour l'industrie
La coloration au rouge Nil permet la visualisation des gouttelettes lipidiques chez les organismes modèles, soutenant ainsi la validation de cibles en recherche sur les maladies métaboliques. La méthode fournit des données quantitatives sur la distribution des lipides, contribuant à l'analyse mécanistique et à la réduction des risques associés aux hypothèses thérapeutiques. Cette approche renforce la fiabilité prédictive en phase précoce de découverte en reliant les modifications phénotypiques des lipides à la modulation des voies métaboliques.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Découverte précoce et validation des cibles
- Valeur scientifique : Interroge des hypothèses thérapeutiques en visualisant l'accumulation de lipides neutres dans les cœurs des gouttelettes lipidiques.
- Valeur opérationnelle : Permet la détection biologique des risques grâce à l'observation directe des organites de stockage des lipides dans des échantillons fixés.
- Valeur prédictive : Facilite le tri des projets en corrélant les phénotypes des gouttelettes lipidiques à des interventions génétiques ou par composés.
Développement de tests et criblage
- Prêt de l'essai : Prépare des systèmes biologiques validés pour le criblage de composés modulant les lipides en aval.
- Production quantitative : Génère des mesures d'abondance lipidique basées sur la fluorescence, permettant la standardisation des essais.
- Évolutivité : Permet une visualisation reproductible des lipides sur plusieurs échantillons, favorisant la réutilisation de la plateforme.
Recherche translationnelle et préclinique
- Pertinence pour les maladies : Relie les phénotypes des gouttelettes lipidiques à des modèles de maladies métaboliques chez C. elegans.
- Continuité translationnelle : Établit un lien entre les observations découverte et la validation préclinique du métabolisme lipidique.
- Décisions adaptées au risque : Informe les critères d'avancement selon les modifications de la distribution lipidique dans des systèmes pertinents pour la maladie.
Intégration du pipeline et du flux de travail
La méthode s'intègre aux flux de travail de découverte précoce en fournissant des profils phénotypiques lipidiques qui éclairent les étapes de validation de cibles et d'identification de composés candidats.
- Découverte en biologie : Permet la vérification d'hypothèses sur les voies du métabolisme lipidique grâce à la visualisation directe des gouttelettes lipidiques.
- Écrantage : Facilite le développement de tests pour les composés affectant le stockage des lipides, grâce à une fixation et une coloration standardisées.
- Analytique : Fournit des mesures quantitatives par fluorescence dans le canal vert afin de comparer l'abondance lipidique entre différentes conditions.
- Recherche translationnelle : Relie les modifications des gouttelettes lipidiques à une continuité préclinique via des mécanismes conservés du métabolisme lipidique.
- Réutilisation en milieu professionnel : Met en place une plateforme de visualisation des lipides réutilisable, applicable à plusieurs souches de nématodes et à diverses conditions.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance prédictive dans la validation des cibles en réduisant l'ambiguïté mécanistique des phénotypes de stockage lipidique.
- Valeur opérationnelle : Garantit la standardisation et la reproductibilité grâce à des protocoles sur échantillons fixés et une manipulation contrôlée des colorants.
- Valeur stratégique : Améliore les décisions d'orientation (go/no-go) en fournissant des ancres phénotypiques fondées sur les lipides pour les cibles métaboliques.
- Impact sur le portefeuille : Permet une priorisation ajustée au risque des composés selon leur efficacité à moduler les gouttelettes lipidiques.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en microscopie à fluorescence et en biologie des lipides pour une interprétation spectrale précise.
- Requiert un instrument capable de détecter l'émission dans le canal vert afin de visualiser les lipides neutres marqués au Nile Red.
- Exige une standardisation inter-équipes des protocoles de fixation, de perméabilisation et des contrôles d'exposition à la lumière.
- Implique des adaptations à prendre en compte lors de l'application de la méthode à différents systèmes modèles ou types de lipides.
- Comprend des limites pratiques telles que la sensibilité du colorant à la lumière et la dépendance à une fixation adéquate de l'échantillon pour l'accès au marquage.
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Dernière mise à jour : 29 août 2026