Placage d’ARNi pour l’alimentation de C. elegans : une technique pour induire l’expression de l’ARNdb cible chez E. coli
JoVE Encyclopedia of Experiments
Biologie
0 vues • 3:24 min • April 30th, 2023
- Chez C. elegans, l’ARNi peut être induit en nourrissant des vers avec des bactéries qui expriment de l’ARN double brin ou de l’ARNdb à partir d’un plasmide d’ADN recombinant.
Pour commencer, cultivez des E. coli HT115 résistants à la tétracycline transfectés avec le plasmide L4440 pendant la nuit sur des plaques sélectives de gélose LB contenant de la tétracycline et de l’ampicilline, ou son analogue fonctionnel la carbénicille. En plus de l’ADN cible, le plasmide contient un gène de résistance à l’ampicilline. Seules les colonies de bactéries qui héritent du plasmide peuvent se développer en présence de ces antibiotiques.
Ensuite, récoltez les colonies de bactéries et développez-les dans un milieu liquide LB jusqu’à la concentration souhaitée. Pour induire l’expression de l’ARNdb, transférez la solution bactérienne sur des plaques gélosées de gélose contenant de l’IPTG préparées pour les nématodes.
Dans ce système d’expression, IPTG imite le lactose pour inactiver le répresseur lac permettant l’expression de l’ARN polymérase T7. Sur le plasmide, l’expression de l’ADN cible est régulée par deux promoteurs T7 convergents. Par conséquent, des séquences sensorielles et anti-sens sont transcrites conduisant à l’expression de l’ARNdb.
Enfin, le ver utilise les informations de séquence de l’ARNdb ingéré pour réguler à la baisse les ARNm endogènes avec des séquences complémentaires. Dans cette expérience, nous préparerons des plaques d’ARNi avec des E. coli transgéniques pour l’alimentation de C. elegans.
- Pour les plaques ARNi, chargez des plaques de 6 centimètres avec de la gélose NGM contenant de l’IPTG et de la carbénicline. Laissez-les sécher pendant 24 à 48 heures à température ambiante dans l’obscurité. Ensuite, transférez-les à 4 degrés Celsius jusqu’à 14 jours.
Ensuite, striez des plaques sélectives contenant de la carbénicilline et de la tétracycline avec des clones de bactéries ARNi avec le plasmide L4440 portant le gène lin-53. Utilisez un motif de stries triphasées et assurez-vous de plaquer un contrôle vectoriel vide. Ensuite, faites pousser les assiettes pendant la nuit à 37 degrés Celsius.
Le lendemain, choisissez au moins trois colonies simples et inoculez chacune d’elles dans un tube de culture séparé avec 2 millilitres de LB complété par de la carbénicline, mais pas de tétracycline. Prévoyez d’avoir trois cultures saines par condition.
Ensuite, cultivez les cultures pendant la nuit à 37 degrés Celsius jusqu’à ce qu’elles atteignent une densité optique de 600 nanomètres de 0,6 à 0,8. Ensuite, ajoutez 500 microlitres de chaque culture bactérienne dans une plaque d’ARNi ggaré NGM de 6 centimètres. Incuber les assiettes toute la nuit à température ambiante dans l’obscurité.
Aperçu
Cet article décrit une méthode permettant d'induire une interférence par ARN (ARNi) chez C. elegans à l'aide de bactéries exprimant un ARN double brin (ARNdb). Le protocole consiste à préparer des boîtes de culture RNAi contenant des souches d'Escherichia coli transgéniques, puis à nourrir les vers avec ces bactéries afin de réduire l'expression des ARNm cibles.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Neurosciences
- Génétique
- Biologie moléculaire
Contexte
- C. elegans est un organisme modèle largement utilisé dans les études génétiques.
- l'ARNi est un outil puissant pour le silençage génique chez divers organismes.
- L'utilisation de l'ARN double brin peut cibler efficacement des ARNm spécifiques pour dégradation.
- Des souches transgéniques d'E. coli peuvent être conçues pour exprimer de l'ARN double brin destiné à des expériences d'alimentation.
Objectif de l'étude
- Démontrer la préparation de plaques d'ARNi pour l'alimentation de C. elegans.
- Illustrer le processus d'induction de l'ARNi par alimentation bactérienne.
- Fournir un protocole détaillé destiné aux chercheurs intéressés par la silencing génique.
Méthodes utilisées
- Culture de E. coli HT115 résistant à la tétracycline contenant le plasmide L4440.
- Préparation de plaques d'agar NGM avec IPTG et carbenicilline.
- Streaking de plaques sélectives avec des clones bactériens d'ARNi.
- Inoculation des cultures et préparation des plaques d'ARNi pour l'alimentation.
Résultats principaux
- Croissance réussie d’E. coli exprimant un ARNsd.
- Préparation de plaques d’ARNi capables d’induire efficacement le silence génique.
- Démonstration de l’applicabilité de la méthode à divers gènes cibles.
- Mise en place d’un protocole fiable pour les expériences d’ARNi chez C. elegans.
Conclusions
- La méthode décrite est efficace pour induire l'ARNi chez C. elegans.
- Des souches d'E. coli transgéniques peuvent être utilisées comme source d'ARN double brin pour l'alimentation.
- Ce protocole peut aider les chercheurs à étudier la fonction des gènes par ARNi.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle pour l'industrie
L'alimentation par ARNi chez C. elegans à l'aide d'E. coli génétiquement modifiée permet une inhibition génique rapide et reproductible à grande échelle, utile à la génomique fonctionnelle et à la validation de cibles en phase précoce de découverte. Cette approche facilite la réduction des risques mécanistiques en permettant l'interrogation directe de la fonction des gènes dans un contexte d'organisme entier. La méthode se situe à l'intersection de la validation de cibles et du développement de tests, offrant une confiance prédictive pour les criblages ultérieurs et les recherches translationnelles.
Applications stratégiques en R&D biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Permet une inhibition systématique des gènes candidats afin de clarifier les voies biologiques.
- Permet la validation fonctionnelle des cibles en associant la suppression génique à des résultats phénotypiques.
- Facilite la réduction des risques mécanistiques en isolant les effets spécifiques à un gène in vivo.
- Offre une plateforme pour des tests rapides d'hypothèses dans des modèles pertinents pour les maladies.
Développement de tests et criblage
- Prépare des systèmes biologiques validés pour le criblage de composés et l'étude des interactions génétiques.
- Standardise les conditions d'extinction génique pour obtenir des résultats quantitatifs reproductibles.
- Permet des protocoles évolutifs et parallélisables, prêts pour le criblage à haut débit.
- Permet une évaluation fiable des effets de composés dans des contextes génétiques définis.
Recherche translationnelle et préclinique
- Aligne les études sur la fonction des gènes avec des modèles de maladies pour l'exploration translationnelle de biomarqueurs.
- Assure la continuité entre la découverte génétique et la validation préclinique dans des systèmes à organisme entier.
- Réduit les risques liés aux décisions d'avancement en fournissant des preuves in vivo de la pertinence de la cible.
- Permet la modélisation prédictive des interactions gène-médicament dans un système exploitable.
Intégration du pipeline et du flux de travail
Cette méthode d'alimentation par ARNi s'intègre dans le continuum de découverte, depuis la validation précoce de cibles jusqu'au développement de tests et à la modélisation préclinique.
- Découverte biologique : Permet un isolement génique fondé sur une hypothèse afin de préciser les rôles des cibles et les voies biologiques.
- Écrantage : Fournit une inhibition génique reproductible et quantitative pour un développement d'essais solide.
- Analytique : Produit des résultats phénotypiques mesurables permettant des comparaisons statistiques entre différentes conditions expérimentales.
- Recherche translationnelle : Établit un lien entre les découvertes génétiques et les modèles précliniques pour la validation de biomarqueurs et de cibles.
- Réutilisation en entreprise : Propose un flux de travail standardisé et réutilisable pour l'analyse de la fonction génique dans plusieurs programmes.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance prédictive et réduit l'ambiguïté mécanistique dans le choix des cibles.
- Valeur opérationnelle : Fournit des protocoles standardisés, évolutifs et reproductibles d'inhibition génique.
- Valeur stratégique : Améliore la qualité des décisions d'avancement ou d'abandon et l'efficacité du capital en permettant une détection précoce des risques biologiques.
- Impact sur le portefeuille : Favorise la priorisation et l'avancement, ajustés au risque, des cibles validées.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en génétique moléculaire et en manipulation de C. elegans.
- Suppose l'accès à une infrastructure pour la transformation bactérienne et la culture sélective.
- Exige une standardisation interéquipes de la préparation des boîtes d'ARNi et de l'induction bactérienne.
- Une adaptation peut être nécessaire selon les gènes cibles ou les souches modèles utilisées.
- Les limites pratiques incluent une efficacité variable de l'extinction génique et des effets hors cible.
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Dernière mise à jour : 29 août 2026