0 vues • 5:51 min • April 30th, 2023
- Prélever des embryons de drosophile vivants et retirer leurs chorions non transparents. Ensuite, sur une lamelle en verre, appliquez une ligne de colle heptane, qui est un adhésif en ruban dissous dans de l’heptane liquide. Pour pouvoir manipuler les embryons maintenant déchotionnés, alignez soigneusement les échantillons en ligne sur l’adhésif.
Transférez la lamelle dans une chambre de déshydratation pour dessécher partiellement les embryons. Cela permettra d’éviter les fuites cytoplasmiques pendant ou après les injections. Ensuite, retirez la lamelle et couvrez les embryons d’huile d’halocarbure pour éviter une déshydratation supplémentaire tout en permettant à l’oxygène de se diffuser dans les embryons.
Pour effectuer la micro-injection, utilisez un système de micro-injection sur un microscope compatible. En regardant à travers les yeux, identifiez à la fois les embryons et l’aiguille préchargée avec la solution d’injection. Ouvrez l’aiguille et assurez-vous qu’elle produit des gouttes liquides constantes et de taille appropriée. Ensuite, amenez l’aiguille à l’intérieur de l’embryon et injectez le volume approprié. Sortez l’aiguille et passez à la suivante, en répétant l’injection pour les embryons restants.
Dans l’exemple de protocole, nous verrons une démonstration de la micro-injection d’embryons de drosophile pour des études d’imagerie en direct de la division cellulaire.
- Avant de mettre en place la lamelle, faites de la colle à l’heptane en déroulant du ruban adhésif double et en le plaçant dans une bouteille de 100 millilitres. Ajoutez environ 50 millilitres d’heptane, fermez la bouteille et bercez-la pendant plusieurs jours.
Avant de préparer les embryons, faites une chambre de déshydratation dans laquelle les embryons seront placés avant l’injection. Pour ce faire, placez une partie d’une parabole de 35 millimètres à l’intérieur d’une boîte de Pétri de 100 millimètres pour faire une « table ». Ajoutez de la drierite, qui est du sulfate de calcium anhydre, autour de celle-ci de sorte que la hauteur de la drierite ne soit pas supérieure à la « table », et couvrez.
Pour commencer à préparer les embryons, il faut d’abord les prélever dans la cage de ponte en changeant la plaque de jus de raisin avec de la levure toutes les heures. Les embryons doivent être imagés environ deux heures après le début de la collecte. Pour préparer la lamelle, placez-la sur un côté d’une lame de microscope et collez les quatre coins vers le bas pour qu’elle ne bouge pas.
À l’aide d’un applicateur à embout de coton, mettez une couche de colle heptane en ligne sur la lamelle. La colle ne doit pas être visqueuse et doit sécher en quelques secondes. S’il est trop épais, ajoutez plus d’heptane.
Enfin, placez un morceau de ruban adhésif double sur la diapositive à côté de la lamelle. À l’aide d’un pinceau humidifié, ramassez soigneusement les embryons de la plaque de jus de raisin et placez-les sur le ruban adhésif double sur la lame.
Ensuite, utilisez la moitié d’une pince à épiler pour rouler les embryons sur le ruban adhésif double jusqu’à ce que le chorion s’ouvre. Prenez l’embryon en le faisant rouler doucement sur le chorion, de sorte qu’il adhère à la pince à épiler, et placez-le sur la colle heptane sur la lamelle avec le côté long de l’embryon parallèle au côté long de la lamelle.
Placez 10 à 20 embryons dans une rangée. Retirez la lamelle et placez-la dans la chambre de déshydratation pendant trois à huit minutes. Le temps dépend de l’humidité locale et de la quantité à injecter. Ensuite, placez la lamelle sur une chambre métallique avec de la graisse sous vide. Enfin, couvrez les embryons avec de l’huile d’halocarbure pour éviter une déshydratation supplémentaire. Les embryons sont maintenant prêts à être injectés.
Tout d’abord, trouvez les embryons sous un objectif 16X. Éloignez les embryons et trouvez l’aiguille sans bouger le plan focal. Centrez l’aiguille et déplacez-la vers le haut sans la déplacer dans la direction X ou Y.
Pour ouvrir l’aiguille, placez le bord de la lamelle dans le champ de vision, mais pas là où se trouvera une aiguille, et abaissez l’aiguille au même plan focal. Très soigneusement, déplacez la lamelle jusqu’à ce qu’elle touche l’aiguille et l’ouvre doucement. Déplacez l’aiguille vers le haut.
Maintenant, voyez les embryons. Abaissez l’aiguille dans l’huile et assurez-vous d’obtenir de belles gouttes de liquide de l’aiguille. Déplacez régulièrement l’embryon dans l’aiguille, injectez une goutte dans l’embryon, puis éloignez l’embryon. Une fois que tous les embryons ont été injectés, ils sont prêts à être observés sur un microscope confocal avec un objectif 60 ou 100X.