C. elegans Dosage de la chimiotaxie : une méthode pour tester la chimiosensation chez les vers

- Pour donner un sens aux conditions rencontrées et y répondre en conséquence, le ver C. elegans possède, entre autres, un système chimiosensoriel très développé capable de détecter une grande variété de produits chimiques différents.

Les neurones sensoriels de la tête, les neurones amphides et labiens internes, ainsi que les neurones de la queue, les neurones phasmides, sont exposés directement ou indirectement par la cuticule aux conditions extérieures. Ces neurones chimiosensoriels codent les informations pertinentes utilisées par le ver pour produire une réponse comportementale appropriée : un comportement appelé chimiotaxie.

Pour tester la réponse chimiotactique à des odorants volatils ou à des signaux hydrosolubles gustatifs, isolez les vers du stade de développement souhaité et exposez-les au produit chimique d’essai sur une arène expérimentale préalablement préparée. Lorsqu’il est exposé à des produits chimiques favorables comme ceux produits par une source alimentaire bactérienne, C. elegans présente une chimiotaxie positive vers la source.

À l’inverse, lorsqu’il est exposé à des produits chimiques moins favorables ou toxiques comme les métaux lourds, le ver présente une chimiotaxie négative, évitant ainsi le produit chimique. Par conséquent, les mutants olfactifs ou gustatifs ne parviennent pas à éviter les produits chimiques aversifs et restent dans des conditions défavorables, contrairement aux animaux de type sauvage qui évitent la condition aversive.

Dans l’exemple de protocole, nous verrons une démonstration d’un test de chimiotaxie, testant l’aversion du ver pour le cuivre.

- Après une nuit d’incubation, retirez les plaques de l’incubateur et, en utilisant le dessous marqué de la plaque comme guide, pipetez 100 microlitres de solution de cuivre 2 à 0,5 molaire fraîchement préparée sur le bord de la gélose pour créer une barrière extérieure en cuivre. Pipetez 25 microlitres de la solution de cuivre deux sulfates pour créer une barrière médiane.

Assurez-vous que la solution de sulfate de cuivre deux n’entre pas en contact avec le patch bactérien et laissez la solution de cuivre sécher sur la plaque. Vérifiez la sécheresse toutes les cinq minutes après le transfert avec un mouchoir de laboratoire en tamponnant légèrement la solution près du bord de la plaque pour discerner.

Immédiatement avant le test, transférez les organismes expérimentaux dans une plaque de gélose exempte de bactéries et laissez les nématodes se déplacer librement pendant une minute pour éliminer l’excès de bactéries.

Ensuite, pipetez 1 millilitre de M9 sur la plaque avec de jeunes adultes qui ont été transférés 24 heures auparavant afin de laver les vers dans un tube de microcentrifugation. Centrifugez les nématodes à 3 000 fois g pendant une minute.

Les vers doivent former une pastille au fond du tube. Aspirez la solution M9 sans perturber la pastille de ver. Ajoutez 1 millilitre de solution M9 à la pastille de ver. Retournez le tube pour mélanger les vers avec la solution.

Si l’excès de bactéries a d’abord été transféré avec les vers, répétez l’opération cinq fois au total. Après le lavage final, aspirez le surnageant jusqu’à ce qu’il reste 100 microlitres de solution M9 et la pastille de ver. Transférez immédiatement les vers de la solution une fois les étapes de lavage terminées.

Pipetez 20 microlitres de la pastille de ver du bas du tube sur la moitié exempte de bactéries de la plaque de dosage. Assurez-vous que 10 vers sont transférés sur la plaque de test et qu’aucun aliment contaminant n’est présent. Aucune bactérie ne doit être transférée sur les plaques de course alimentaire en cuivre.

Retirez l’excès de solution M9 des nématodes avec un mouchoir de laboratoire en une minute. Assurez-vous que la solution M9 n’entre pas en contact avec la solution de sulfate de cuivre et que la surface des vers et de la gélose reste intacte. Jetez les vers qui ont été accidentellement retirés avec le tissu de laboratoire.

Une fois que la solution M9 a été retirée et que tous les vers ont commencé à schémas locomoteurs non liquides, c’est-à-dire lorsqu’ils ont cessé de se débattre, démarrez le chronomètre du dosage. Si des vers supplémentaires ont été accidentellement inclus, retirez-les en les cueillant avec de l’huile d’halocarbure pour vous assurer qu’aucune bactérie n’est ajoutée à la plaque.

Vérifiez les plaques de test toutes les 30 minutes. Pour les plaques de test avec des patchs bactériens, notez positivement les organismes s’ils ont atteint le patch alimentaire sur une période de quatre heures. Pour les plaques de contrôle négatives, notez positivement les organismes s’ils ont franchi la barrière.