C. elegans Suivi des mouvements : une méthode pour évaluer la locomotion chez les vers

- Pour évaluer la locomotion chez C. elegans, utilisez une caméra pour enregistrer le mouvement des vers sur une plaque de gélose, en assurant un éclairage uniforme de la plaque pendant l’enregistrement. Pour limiter le mouvement des vers autour de la plaque, utilisez des anneaux en cuivre. Le cuivre est réfractaire à C. elegans, de sorte que les vers sont regroupés dans les anneaux.

Placez plusieurs anneaux de cuivre sur une plaque pour suivre simultanément les vers dans chaque anneau. Cela permet d’effectuer l’évaluation des animaux témoins et des animaux de laboratoire dans des conditions identiques, ce qui réduit la variabilité quotidienne et permet des comparaisons côte à côte. Enregistrez le mouvement des vers sur des intervalles de temps définis et utilisez un logiciel informatique pour analyser les caractéristiques du comportement de la locomotive, telles que la vitesse de déplacement et la distance parcourue.

Dans l’exemple de protocole, nous verrons une démonstration d’un test de suivi de mouvement testant les effets de l’alcool sur la vitesse de locomotion du ver.

- Pour commencer, prenez deux minutes ou moins pour transférer 10 vers de chaque groupe expérimental au centre d’un anneau de cuivre sur une plaque d’acclimatation. Il s’agit d’une plaque sans éthanol. Évitez de transférer de la nourriture avec les vers car cela réduira leurs mouvements. Évitez également d’endommager la surface de la gélose car les vers s’enfouiront. Enregistrez le temps de chargement sur la plaque et assurez-vous d’échelonner le transfert des vers vers sur chaque plaque de plus de deux minutes, afin que chaque plaque puisse être filmée individuellement à l’intervalle de temps approprié.

Laissez chaque plaque d’acclimatation incuber à température ambiante pendant 30 minutes. Ensuite, transférez les vers sur la plaque d’essai, en suivant l’ordre utilisé pour placer les vers sur la plaque d’acclimatation. À l’aide d’un pic à vers aplati à bords minces sans bactéries, collectez les vers sur le dessus du pic aplati en utilisant un mouvement de ramassage. Ensuite, scellez la plaque avec un film de laboratoire pour minimiser la perte d’éthanol par vaporisation.

- La vitesse à laquelle les animaux sont transférés à cette étape est très importante, car les animaux transférés seront exposés à l’éthanol plus longtemps. C’est donc une bonne idée de faire pivoter les souches qui sont placées en premier sur la plaque sur les répétitions expérimentales.

- Un microscope avec une caméra vidéo haute résolution est maintenant nécessaire pour filmer les vers. Même l’éclairage, par exemple à partir d’un rétroéclairage carré de trois pouces, est essentiel pour l’analyse. Ensuite, pour maintenir le contraste, imagez le support de la plaque côté vers le haut.

Préparez le logiciel d’analyse d’image pour capturer des vidéos en accéléré de 120 images, 12 bits, en niveaux de gris et en une image par seconde. Pour réduire la taille du fichier de sortie, tout en conservant une résolution d’image suffisante, utilisez un mode de regroupement deux par deux.

Enregistrez maintenant des vidéos de deux minutes à partir de chaque plaque, 10 minutes après que les derniers vers aient été placés sur cette plaque. Ensuite, faites un deuxième enregistrement de deux minutes, 30 minutes après que les vers aient été placés sur la plaque. Pour cette démonstration, le logiciel Image-Pro Plus est utilisé, car une grande variété d’autres logiciels peuvent être adaptés à la technique. Analysez les films sous forme de segments de deux minutes.

Tout d’abord, appliquez un filtre aux images qui aplatit l’arrière-plan et améliore le contraste des objets ver. Dans le menu, sélectionnez Traiter, puis Filtres, puis Amélioration, puis Aplatir. Définissez le paramètre pour un arrière-plan sombre et une largeur de fonction de 20 Pix.

Maintenant, analysez la locomotion des animaux dans chaque anneau séparément avec une région circulaire d’intérêt qui chevauche l’anneau de cuivre. Identifiez et suivez les vers à l’aide de la commande Suivre les objets du sous-menu Mesurer.

Dans la fenêtre Tableau des données de suivi, utilisez le bouton Options de suivi pour autoriser l’exclusion de pistes spécifiques et pour limiter les artefacts expérimentaux. Sous l’onglet Suivi automatique, définissez les paramètres de piste sur une limite de vitesse de 400 microns par image. Définissez la limite d’accélération sur Automatique.

Définissez la longueur totale minimale de la piste sur 400 microns et le type de mouvement prédominant sur Chaotique. Ensuite, sous le paramètre Piste, définissez les objets pour permettre aux pistes partielles d’avoir une longueur minimale de 21 images et d’avoir une profondeur de projection de suivi d’une image.

Maintenant, pour lancer le processus de suivi, cliquez d’abord sur le bouton de fonction Rechercher automatiquement toutes les pistes. La boîte de dialogue Options de comptage/taille et la boîte de dialogue Suivi s’affichent. Sélectionnez l’option Manuel pour la sélection de la plage d’intensité dans la boîte de dialogue Nombre/Taille. Il s’agit d’une étape de seuil importante. Ajuste ensuite les curseurs Seuil d’intensité pour créer une plage inclusive qui met en évidence les objets sombres. Un bon point de départ sur l’échelle se situe entre 0 et 1 500.

Appliquez maintenant un filtre de taille pour exclure les objets qui sont plus grands ou plus petits qu’un seul ver. Allez dans le menu Mesure, puis sélectionnez Sous-menu Mesure. La boîte de dialogue Options de comptage/taille s’ouvre. Là, définissez la plage de surface sur 28 000 à 120 000 microns carrés. Et réglez la plage de périmètre sur 600 à 2 500 microns. Ajustez ces paramètres lorsque vous utilisez des vers de taille anormale.

Maintenant, terminez le processus de suivi en cliquant sur Continuer dans la boîte de dialogue de suivi. Vérifiez que la sortie est suivie avec le métrage vidéo. Assurez-vous que chaque ver est représenté à moins qu’il n’y ait une raison claire de le filtrer. Ensuite, supprimez manuellement les pistes produites par des objets non worm.

Ensuite, calculez la vitesse de chaque ver en faisant la moyenne de la distance parcourue entre chaque image ou chaque seconde, et créez une vitesse moyenne pour les pistes dans chaque population. Considérez cette moyenne finale comme un point d’échantillonnage pour l’analyse statistique de l’expérience.