0 vues • 2:23 min • April 30th, 2023
- Placez un ver transgénique exprimant GCaMP - une protéine de détection du calcium - dans une chambre d’imagerie avec de la nourriture bactérienne pour le ver. Fermez ensuite le plat avec le couvercle et le film de laboratoire pour éviter l’évaporation. Observez-le sous un microscope composé équipé pour l’épifluorescence à grand champ. Enregistrez des images en accéléré des vers pour suivre leur comportement et capturer la fluorescence à l’aide d’un logiciel d’imagerie.
Les vers transgéniques expriment une protéine capteur GCaMP sous le contrôle d’un promoteur qui pilote l’expression de GCaMP dans un neurone spécifique. Lorsque ce neurone est activé, il déclenche un potentiel d’action, ce qui dépolarise la membrane plasmique. Lors de la dépolarisation, des canaux calciques voltage-dépendants s’ouvrent dans la membrane plasmique. Cela provoque un afflux d’ions calcium dans la cellule, entraînant une excitation neuronale.
GCaMP dans le neurone excité se lie aux ions calcium. Cela provoque la fluorescence de GCaMP lorsque les vers sont imagés avec une lumière d’excitation de fluorescence de faible intensité. Dans l’exemple de protocole, nous utiliserons l’imagerie calcique pour visualiser l’activité des interneurones AVA chez C. elegans transgéniques dans des microchambres d’agarose.
- L’imagerie calcique est réalisée sur un microscope composé équipé pour l’épifluorescence à grand champ. Pour limiter l’exposition à la lumière, utilisez un signal logique transistor-transistor qui déclenche une LED pour éclairer l’échantillon en même temps que la caméra enregistre une image.
Exécutez un film en rafale pendant 24 heures qui enregistre chaque ver toutes les 15 à 30 minutes. Tout d’abord, enregistrez 20 secondes avec DIC, puis 20 secondes avec la fluorescence GFP, et enfin, une image du signal mKate2 pour contrôler les niveaux d’expression.
Pour l’inspection visuelle des données, utilisez une carte en fausses couleurs pour améliorer la visibilité des petits changements d’intensité de fluorescence. Enfin, effectuez l’analyse des données sur le calcium à l’aide de procédures standard.