JoVE Encyclopedia of Experiments
Biologie
0 vues • 3:21 min • April 30th, 2023
- Pour commencer, transférez les jeunes vers adultes sur un tampon d’agarose frais sur une lame. Ajoutez ensuite quelques gouttes de solution de lévamisole à 12 millimolaires pour paralyser les vers. Couvrez les vers avec une lamelle et attendez quelques minutes. Placez la lame sous un microscope confocal à disque rotatif et concentrez-vous sur la surface latérale externe du ver.
L’épiderme d’un ver adulte est une mince structure monocouche composée de syncytia multinucléés qui résultent d’événements de fusion cellulaire. La surface apicale de l’épiderme sécrète une cuticule collagène flexible, tandis que la surface basale est recouverte d’une fine couche de matrice extracellulaire appelée lame basale.
Ensuite, enroulez la surface apicale de l’épiderme avec un laser. Le cytoplasme des cellules endommagées peut s’échapper, apparaissant sous la forme d’une bulle au site de la plaie.
L’irradiation laser présente un avantage par rapport à d’autres techniques, telles que la blessure à l’aiguille, car elle provoque une perturbation localisée de la cuticule et des cellules épidermiques, sans endommager les tissus internes. Dans l’exemple de protocole, nous verrons le processus de blessure au laser chez C. elegans.
- Pour blesser précisément les nématodes, ce protocole utilise un laser femtoseconde fixé à un microscope confocal à disque rotatif. Des balayages linéaires ou ponctuels à l’aide de lasers femtosecondes, tels que ceux des microscopes à deux photons, devraient également suffire.
- Commencez par recueillir 10 jeunes adultes sur une gélose. Paralysez-les dans une goutte de deux microlitres de solution de lévamisole de 12 millimolaires. Ensuite, couvrez-les avec une gaine et attendez quelques minutes pendant qu’ils paralysent.
- Il est essentiel qu’un animal soit complètement paralysé. 12 millimolaires de lévamisole n’affecteront pas la réponse de la plaie. Cependant, d’autres méthodes d’immobilisation peuvent également être utilisées.
- Assurez-vous que la puissance du laser femtoseconde est réglée sur 140 milliwatts, telle que mesurée avant l’objectif, et que le taux de répétition du laser est de 80 mégahertz. Maintenant, localisez les vers à l’aide d’un microscope confocal à disque rotatif. À l’aide d’un objectif 100x avec une grande ouverture numérique, faites la mise au point sur l’épiderme syncytial latéral, antérieur ou postérieur du ver cible.
En se concentrant sur la surface apicale de la cellule épidermique, faites briller le laser pendant deux impulsions de 200 millisecondes séparées de 20 millisecondes. Cela devrait suffire à blesser l’épiderme. Attendez un moment et observez la perturbation locale du cytoplasme, qui apparaîtra sous forme de bouillonnement. Si un marqueur fluorescent est présent, un blanchiment localisé peut être observé.