Application des ultrasons à basse fréquence : une méthode pour déterminer l’effet de la sonication sur les cellules leucémiques humaines

- Pour commencer, ensemencez les cellules leucémiques humaines dans un milieu de culture fraîchement préparé et incubez pendant la période souhaitée. Après l’incubation, colorez une petite quantité de cette suspension cellulaire avec du bleu trypan et évaluez la viabilité cellulaire à l’aide d’une lame de compteur de cellules TC20. Les cellules mortes sont perméables et absorbent le colorant chargé négativement, tandis que les cellules viables sont imperméables.

Ensuite, ajoutez de la méthylbêta-cyclodextrine dans le ballon de culture pour épuiser suffisamment le cholestérol des cellules, ce qui les rend sensibles aux ultrasons. Incuber les cellules pendant la période souhaitée. Remplissez le système de sonication cellulaire avec de l’eau déminéralisée et dégazez-le pendant quelques minutes pour éviter les bulles de vide. Transférez la quantité souhaitée de cellules dans le flacon à scintillation et fixez le flacon au dispositif de maintien du système de sonication cellulaire.

Placez le dispositif de maintien sur le dessus de la corne et réglez l'élévation souhaitée par rapport au haut de la corne. Réglez les impulsions requises pendant la durée souhaitée pour soniser les cellules. Ajoutez du bleu trypan à la suspension cellulaire et placez-le dans le compteur de cellules TC20 pour analyser la viabilité et les dommages cellulaires. Les cellules leucémiques traitées à la méthylbêta-cyclodextrine, lorsqu’elles sont exposées à des ultrasons à basse fréquence, présentent une lyse cellulaire significative.

Dans le protocole suivant, nous étudierons la sonication cellulaire et l’évaluation des dommages des cellules leucémiques humaines.

- Pour préparer les cellules à la sonication, ensemencez-les d’abord à 4 fois 10 à la quatrième cellules par millilitre dans un ballon de 25 centimètres carrés en utilisant un milieu fraîchement préparé. Après avoir déterminé le nombre de cellules viables par exclusion du bleu de trypan, incubez la culture à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone jusqu’à ce que la culture ait atteint la concentration souhaitée. Lorsque les cellules sont prêtes pour la sonication, utilisez un vide et une fiole de Buchner pour dégazer un volume d’eau distillée ionisée. Utilisez ensuite l’eau pour remplir la corne de la tasse jusqu’à 15 millimètres au-dessus du haut de la corne.

Faites fonctionner le système avec de l’eau dégazée pendant environ sept minutes, puis transférez 3 millilitres de cellules dans un flacon à scintillation en verre de 20 millilitres et fixez le flacon au dispositif de maintien. Ensuite, fixez le dispositif de maintien au sommet de la corne de la tasse et utilisez le mécanisme coulissant pour régler le dispositif de maintien à une élévation de 15 millimètres du haut de la corne à la surface de l’eau. Maintenant, sonisez les cellules à l’aide de trois impulsions d’ultrasons d’une seconde avec un espacement d’une seconde entre chacune des impulsions à une amplitude de 33 % et 50 %.

Evaluer la viabilité cellulaire après sonication par exclusion du bleu trypan. Pour évaluer les dommages cellulaires, rincez l’ouverture d’un analyseur de particules Z2 au moins 2 fois avec une solution saline isotonique. Ensuite, ajoutez 100 microlitres de cellules soniquées dans 20 millilitres de solution saline isotonique et transférez l’échantillon de cellules dans le support du compteur. Ensuite, soulevez la plate-forme jusqu'à l'ouverture et analysez les dommages aux cellules, la viabilité et les débris selon les instructions du fabricant.