Encyclopédie des expériences JoVE
Recherche sur le cancer
0 vues • 3:20 min • April 30th, 2023
- Les ondes ultrasonores à basse fréquence conduisent à la lyse sélective des cellules leucémiques humaines et le test XTT aide à déterminer le degré de ces dommages. Le test fonctionne sur le principe que les enzymes mitochondriales des cellules saines convertissent un colorant XTT jaune en un composé orange appelé formazan. Pour commencer le test, traitez les cellules avec de la méthylbêta-cyclodextrine, un agent appauvrissant le cholestérol, puis sonicez les cellules à faible puissance pour induire des dommages cellulaires.
Centrifuger pour granuler les cellules et ajouter un nouveau milieu de croissance cellulaire à la pastille. Ensemencez les cellules à la concentration souhaitée dans une microplaque multi-puits et incubez-la pendant la nuit. Maintenant, ajoutez la solution XTT activée aux cellules et incubez jusqu'à ce que la couleur orange se développe dans les puits de la microplaque. Placez la plaque dans un spectrophotomètre. Mesurez l’absorbance à 450 à 500 nanomètres puis à 630 à 690 nanomètres. Soustrayez les deux valeurs pour obtenir des résultats précis. La valeur plus élevée de l’absorbance dans le test XTT indique une activité plus élevée des enzymes mitochondriales et une viabilité cellulaire plus élevée.
Dans la vidéo suivante, nous démontrerons l’utilisation du test XTT pour déterminer l’efficacité des ondes ultrasonores à basse fréquence pour causer des dommages cellulaires dans les cellules leucémiques traitées à la méthylbêta-cyclodextrine.
- Pour évaluer la viabilité des cellules soniquées par le test XTT, sonicez les cellules à l’aide d’une plage d’une à trois impulsions d’une seconde, à une seconde d’intervalle, afin de développer une gamme de dommages que le kit XTT doit évaluer. Ensuite, faites tourner les cellules et remettez les granulés en suspension à 1 fois 10 à la cinquième cellules par millilitre dans un milieu de croissance fraîchement préparé. Ensuite, ensemencez 100 microlitres de cellules par puits dans des plaques de microtitration individuelles à fond plat de 96 puits en trois exemplaires, y compris trois puits de contrôle contenant 100 microlitres de milieu de croissance complet seul pour les lectures d’absorbance à blanc. Incuber les cellules pendant 24 heures.
Le matin du test, faites tourbillonner doucement des aliquotes de réactifs XTT et d’activation chauffés à 37 degrés Celsius jusqu’à ce que les solutions soient claires. Ajoutez ensuite 0,1 millilitre du réactif d’activation à une aliquote de 5 millilitres du réactif XTT. Ensuite, ajoutez 50 microlitres de la solution XTT activée dans chaque puits des plaques inoculées U937 et THP1 et renvoyez les cellules dans l’incubateur de culture cellulaire. Au bout de deux heures, secouez doucement les plaques pour répartir uniformément le colorant orange dans les puits positifs et mesurez l’absorbance sur un lecteur de plaques de microtitration entre 450 et 500 nanomètres. Enfin, mesurez à nouveau l’absorbance de tous les puits d’analyse entre 630 et 690 nanomètres.