Dosage du marquage pulsé de la bromodéoxyuridine : une technique pour mesurer la prolifération cellulaire

- Commencer avec une suspension de cellules leucémiques contenant la densité cellulaire désirée. Centrifugez et mettez en suspension les cellules dans un milieu de culture contenant du sérum. L’ajout de sérum favorise la croissance cellulaire continue et les cellules se déplacent à travers les différentes phases du cycle cellulaire. Diluez les cellules dans une solution de marquage à la bromodéoxyuridine, ou BrdU, et cultivez-les dans des conditions physiologiques pendant la durée requise.

Les cellules en phase de synthèse ou en phase S absorbent BrdU - un analogue de la thymidine - qui remplace la thymidine pendant le processus de réplication de l’ADN. Centrifugez les cellules pour éliminer l’excès de BrdU et remettez les cellules en suspension dans un milieu approprié. Transférez les cellules dans une plaque à plusieurs puits. Permettre aux cellules de se développer dans des conditions physiologiques pendant différentes périodes.

À différentes périodes, les cellules progressent à travers le reste des phases S, G2, mitose et G1 et entrent dans le cycle cellulaire suivant, ce qui permet d’estimer la prolifération cellulaire. Effectuez une coloration des anticorps pour marquer BrdU avec un anticorps fluorochrome et mesurez la prolifération cellulaire à l’aide de la cytométrie en flux.

À l’intérieur du cytomètre en flux, les fluorochromes absorbent l’énergie laser et deviennent fluorescents. Le nombre de cellules proliférantes est directement corrélé à la fluorescence observée. Dans l’exemple de protocole, nous démontrerons le marquage pulsé des cellules de leucémie lymphoblastique aiguë.

- Ce protocole utilise la lignée cellulaire de la leucémie lymphoblastique aiguë, NALM6, mais peut être appliqué à toute lignée cellulaire non adhérente. Maintenir les cellules NALM6 dans des flacons de culture T-75 dans un RPMI complet à 37 degrés Celsius dans 5 % de dioxyde de carbone dans l’air. Après avoir collecté les cellules et effectué un comptage cellulaire, remettez les cellules en suspension dans un RPMI complet à raison de 2 fois 10 à 6 cellules par millilitre.

Diluez les cellules 1 en 2 avec BrdU Complete RPMI pour produire une concentration cellulaire finale de 1 fois 10 à 6 cellules par millilitre. Manipulez BrdU avec précaution car il s’agit d’un mutagène et d’un tératogène potentiels. Incuber à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone pendant 45 minutes.

Ensuite, diluez les cellules 1 sur 10 avec Complete RPMI. Centrifugez à 150 fois G pendant cinq minutes et jetez soigneusement tout le surnageant. Remettez les cellules en suspension dans un petit volume de RPMI complet, effectuez un comptage cellulaire et ajustez la concentration cellulaire à 1 fois 10 à 6 cellules par millilitre. Pipeter 1 millilitre de cellules dans chaque puits d’une plaque de 48 puits.

Pipetez 1 millilitre de DPBS dans tous les puits inoccupés pour obtenir des résultats plus reproductibles. Incuber à 37 degrés Celsius dans 5 % de dioxyde de carbone dans l’air pendant les points de temps souhaités, en fonction de ce que la conception expérimentale vise à mesurer. Lorsque l’incubation est terminée, transférez toutes les cellules dans des tubes FACS.

Rincez chaque puits séquentiellement avec des volumes de 1 millilitre de PBS jusqu’à un volume total final de 5 millilitres. Centrifugez à 150 fois G pendant cinq minutes et retirez soigneusement tout le surnageant. Les cellules sont maintenant prêtes pour la coloration, qui doit être effectuée immédiatement. Si une coloration de surface est nécessaire, elle doit être effectuée maintenant, avant la fixation.