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0 vues • 3:24 min • April 30th, 2023
- La bromodéoxyuridine ou BrdU est un analogue nucléosidique synthétique de la thymidine. Au cours de la phase de synthèse du cycle cellulaire, BrdU substitue la thymidine et s’intègre dans l’ADN nouvellement synthétisé. Le BrdU incorporé permet de suivre la progression du cycle cellulaire. Pour détecter le BrdU incorporé, il faut d’abord fixer et perméabiliser les cellules pour les rendre perméables.
Ensuite, traitez les cellules avec l’enzyme DNAse pour cliver les brins d’ADN et exposer le BrdU incorporé. Par la suite, ajoutez un anticorps anti-BrdU marqué fluorescent approprié. L’anticorps pénètre dans le noyau et se lie facilement à la BrdU exposée présente dans l’ADN.
De plus, traitez les cellules avec un colorant fluorescent approprié pour se lier à l’ADN. Le colorant se lie à l’ADN, ce qui permet de quantifier le contenu total en ADN. Utilisez la cytométrie en flux pour détecter la fluorescence à partir du BrdU marqué et de l’ADN.
Les intensités de fluorescence de l’ADN marqué différencient les cellules dans différentes phases du cycle cellulaire en fonction de la variation de la teneur totale en ADN. Le signal fluorescent de BrdU identifie la position actuelle du cycle cellulaire des cellules incorporées à BrdU.
Dans cet exemple, nous allons effectuer la coloration immunofluorescente BrdU des cellules de leucémie lymphoblastique aiguë NALM-6.
- Avant la coloration des anticorps, traitez les cellules avec de la DNAse. Remettre les cellules en suspension dans 100 microlitres de solution de DNAse et incuber pendant une heure à 37 degrés Celsius. Ajoutez un millilitre de tampon de lavage, centrifugez les cellules et jetez le surnageant. La coloration des anticorps pour les marqueurs intracellulaires autres que BrdU peut être effectuée en même temps que la coloration BrdU.
- Il est important de préparer des contrôles de compensation composés de cellules non colorées et de cellules marquées avec chaque fluorochrome. Idéalement, utilisez les mêmes anticorps pour les contrôles de compensation que ceux utilisés dans les tubes expérimentaux.
- Remise en suspension des cellules dans 50 microlitres de tampon de lavage avec un microlitre pour 10 à 6 cellules d’anticorps BrdU. Si vous utilisez des anticorps dirigés contre d’autres antigènes intracellulaires spécifiques, ils doivent être ajoutés à ce stade. Incuber les cellules pendant 20 minutes à température ambiante.
Après 20 minutes, lavez les cellules avec un millilitre de tampon de lavage comme indiqué précédemment. Enfin, colorez l’ADN pour l’analyse du cycle cellulaire. Détachez la pastille en donnant un coup sur le tube et ajoutez 20 microlitres de la solution 7-AAD. Il est essentiel d’utiliser une quantité constante de 7-AAD par cellule. Remettez les cellules en suspension dans un millilitre de tampon de coloration. Par la suite, effectuez une analyse par cytométrie en flux.