Prélèvement sanguin rétro-orbitaire : méthode d’isolement de cellules mononucléées du sinus rétro-orbitaire d’une souris

- Tout d’abord, tenez une souris anesthésiée par le cou et faites saillir l’œil. Insérez un tube capillaire fin dans le canthus médial de l’œil. Permettez au sang de circuler par capillarité dans un tube. Transférez le sang dans un tube recouvert d’EDTA et maintenez-le sur de la glace. L’EDTA lie les ions calcium, empêchant la coagulation du sang. Une température plus basse réduit l’activité glycolytique des cellules et les risques de contamination microbienne.

Ensuite, diluez le sang avec un tampon contenant de l’EDTA et mélangez bien. Ajoutez soigneusement une couche d’une solution de séparation appropriée au fond, sans déranger le sang. Centrifuger la suspension. Le polymère dans la solution de séparation agrège les globules rouges et les sédiments au fond. Les cellules mononucléées et les plaquettes, étant plus légères que le polymère, se déposent au-dessus du gradient polymère.

Retirez la couche supérieure contenant le plasma et récupérez l’anneau blanc opaque contenant les cellules mononucléaires. Diluez les cellules à l’aide de PBS et d’une centrifugeuse pour éliminer le plasma et les plaquettes résiduels. Utilisez les cellules mononucléées isolées pour une analyse plus approfondie. Le protocole suivant démontrera l'isolement de cellules mononucléées à partir d'une souris congénique injectée avec une lignée cellulaire leucémique C1498.

- Insérez un tube capillaire dans le canthus médial de l’œil de l’animal leucémique anesthésié. 100 à 200 microlitres de sang seront prélevés du sinus orbitaire dans le tube capillaire. Retirez le tube et contrôlez le saignement en appliquant doucement une éponge de gaze stérile sur l’œil. Ensuite, transférez le sang dans un tube EDTA et stockez le tube sur de la glace jusqu’à l’isolement de la cellule mononucléaire.

Pour isoler les cellules mononucléées sanguines, ajoutez d’abord du PBS complété par 1 millimolaire d’EDTA jusqu’à un volume final de 500 microlitres. Ensuite, transférez l’échantillon dans un tube de microcentrifugation. Ensuite, utilisez une seringue de 1 millilitre équipée d’une aiguille de calibre 30 pour superposer soigneusement 500 microlitres de solution de séparation sous le sang, en prenant soin de ne pas mélanger les couches.

Séparez les cellules par centrifugation et utilisez une pipette pour transférer la couche de cellule mononucléée blanche opaque dans un nouveau tube de microcentrifugation. Ensuite, lavez les cellules immunitaires dans 1 millilitre de PBS. Centrifugez-les et remettez en suspension la pastille dans 600 microlitres de tampon FACS pour la coloration et l’analyse par cytométrie en flux.