Centrifugation à gradient de densité : une méthode pour isoler les cellules de la LLC du sang périphérique

- Chez les patients atteints de leucémie lymphoïde chronique, ou LLC, les lymphocytes B augmentent considérablement dans la moelle osseuse et le sang. Pour isoler ces cellules de la LLC à partir d’un échantillon de sang, il faut d’abord traiter l’échantillon avec un cocktail d’enrichissement en lymphocytes B humains qui sépare les lymphocytes B en utilisant la sélection négative. Les anticorps du cocktail reconnaissent et réticulent spécifiquement les antigènes exprimés par les cellules non B et les érythrocytes, formant des complexes denses.

Ensuite, superposez l’échantillon sur un milieu à gradient de densité ayant une densité optimale pour l’isolement des lymphocytes. Lors de la centrifugation ultérieure, les différents composants sanguins se séparent en fonction des variations de leurs densités par rapport au milieu à gradient. Les complexes de globules rouges non B avec des densités plus élevées se déposent à travers le milieu, formant une pastille. La fraction plasmatique la moins dense forme la couche supérieure. Les cellules de la LLC moins denses forment une couche blanche à l’interface plasma-milieu de densité.

Transférez délicatement la couche blanche dans un tube frais. Centrifuger à nouveau pour obtenir une pastille contenant des cellules de LLC purifiées. Dans le protocole suivant, nous montrons l’isolement de cellules de leucémie lymphoïde chronique, à partir d’échantillons de sang de patients.

- Obtenir des échantillons de sang périphérique de patients atteints de leucémie lymphoïde chronique précédemment consentis dans des tubes de prélèvement sanguin EDTA accompagnés du nombre de globules blancs.

- Les échantillons de sang humain doivent être considérés comme dangereux, car ils peuvent contenir des virus transmissibles par le sang. Veuillez vous assurer que ces échantillons sont manipulés dans une enceinte de biosécurité de classe II et que l’utilisateur porte une blouse de laboratoire et des gants en tout temps. Éliminez les matériaux contaminés par le sang et désinfectez-les.

- Si le nombre de globules blancs est égal ou supérieur à 40 millions de cellules par millilitre, diluez l’échantillon dans un rapport de 1 à 1 avec un tampon de lavage RT LLC. Ensuite, aliquote du milieu à gradient de densité RT dans un tube à centrifuger conique de taille appropriée pour l’échantillon. Superposez soigneusement l’échantillon sur le fluide et centrifugez-le à 400 fois G pendant 30 minutes à RT.

À l’aide d’une pipette pasteur en plastique, récoltez délicatement la couche blanche de cellules mononucléées qui s’est accumulée à l’interface du milieu à gradient de densité et du tampon de lavage CLL. Transférez cette monocouche isolée dans un tube à centrifuger conique frais de 50 millilitres. Pour laver les cellules, ajoutez 40 millilitres de tampon de lavage CLL à cette monocouche et centrifugez à 300 fois G pendant 10 minutes à température ambiante.

Jetez le surnageant, effleurez le fond du tube pour remettre la pastille en suspension et répétez ce lavage. Jetez le surnageant, relancez le fond du tube, puis remettez la pastille en suspension dans un volume défini de tampon de lavage CLL, en fonction de la taille de la pastille. Après avoir compté les cellules et après la cytométrie en flux pour vérifier la pureté cellulaire, placez les cellules dans des plaques de culture tissulaire à la densité cellulaire requise, prêtes pour la stimulation ou le traitement médicamenteux.