JoVE Encyclopedia of Experiments
Recherche sur le cancer
0 vues • 4:39 min • April 30th, 2023
- Le test de flux extracellulaire permet d’étudier le métabolisme cellulaire en mesurant les deux principales voies énergétiques : la glycolyse et la respiration mitochondriale. Au cours de la glycolyse, les cellules métabolisent le glucose et sécrètent du lactate dans l’espace extracellulaire avec des protons, déterminé en mesurant le taux d’acidification extracellulaire ou ECAR. Pendant la respiration mitochondriale, les cellules utilisent l’oxygène pour la production d’ATP, mesurée en déterminant le taux de consommation d’oxygène ou OCR.
Les cellules cancéreuses présentent une absorption élevée du glucose car elles modifient leur taux métabolique pour s’adapter et maintenir une prolifération cellulaire non régulée. Pour analyser le métabolisme dans les cellules cancéreuses, assemblez d’abord une microplaque d’analyse de flux contenant une monocouche de cellules cancéreuses adhérentes et une cartouche de capteur hydratée. Transférez l’ensemble de plaques dans un analyseur de flux. À l’intérieur de l’analyseur, les sondes du capteur descendent pour créer une microchambre transitoire. Pour mesurer le flux extracellulaire, l’orifice d’injection introduit les composés de test dans la microplaque à des points temporels prédéfinis.
En fonction du métabolisme cellulaire, les concentrations d’oxygène disponibles et de protons libérés dans la microchambre fluctuent. Deux fluorophores intégrés à la base de la cartouche détectent et mesurent simultanément les niveaux d’oxygène et de protons, indiquant respectivement la respiration mitochondriale et la glycolyse. Dans le protocole suivant, nous ferons la démonstration d’un test de flux extracellulaire pour mesurer l’activité métabolique des cellules leucémiques primaires.
- Pendant ce temps, pour préparer les plaques à l’analyse des flux extracellulaires, ajoutez 12,5 microlitres de solution adhésive cellulaire dans chaque puits de deux plaques d’analyseur de flux extracellulaire à 8 biens. Après 20 minutes, aspirez l’adhésif cellulaire et lavez bien chaque fois avec 200 microlitres d’eau stérile par lavage.
Après le deuxième lavage, laissez les plaques dans la hotte jusqu’à ce que les puits soient secs, et placez la cartouche du capteur à l’envers sur la paillasse du laboratoire. Séparez la plaque utilitaire et la cartouche du capteur de l’analyseur de flux, et remplissez chaque puits de la plaque utilitaire avec 200 microlitres de calibrant et chaque fossé autour de l’extérieur des puits avec 400 microlitres de calibrant.
Remettez la cartouche du capteur sur la plaque utilitaire qui contient maintenant l’étalon et placez l’ensemble de cartouche dans un incubateur humidifié à 37 degrés Celsius sans CO2 pendant la nuit. Allumez ensuite l’analyseur de flux extracellulaire et laissez-le chauffer à 37 degrés Celsius pendant la nuit.
Le lendemain matin, transférez les cellules du ballon dans des tubes coniques de 50 millilitres pour la centrifugation, et remettez les granulés en suspension dans 1 millilitre du milieu expérimental approprié pour le comptage. Remettez les cellules en suspension à 4 fois 10 à 6 cellules dans 400 microlitres de concentration de milieu expérimental et ajoutez 50 microlitres de cellules dans les puits B à G de la plaque de l’analyseur de flux, et 180 microlitres du milieu expérimental dans les puits A et H comme puits de contrôle d’arrière-plan.
Après la centrifugation, ajoutez lentement et soigneusement 130 microlitres du milieu expérimental dans les puits B à G, et confirmez visuellement l’adhérence stable des cellules au fond de chaque puits au microscope. Remettez ensuite la plaque d’analyse de flux dans l’incubateur humidifié à 37 degrés Celsius sans CO2 pendant 30 minutes.
20 minutes avant la fin de l’incubation, chargez les composés dans les orifices d’injection appropriés de la cartouche conformément au protocole expérimental, comme indiqué dans le tableau. Mettez ensuite en place le programme d’analyse des flux extracellulaires approprié. Démarrez le programme et remplacez la plaque d’étalonnage par la plaque de test lorsque vous y êtes invité.