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Recherche sur le cancer
0 vues • 3:57 min • April 30th, 2023
- Les lymphocytes T, une classe de lymphocytes, jouent un rôle actif dans la lutte contre les infections. Comme plusieurs autres types de cellules sanguines, les lymphocytes T immunocompétents sont présents dans la rate et les ganglions lymphatiques de la souris. Pour isoler sélectivement les lymphocytes T, prélevez la rate et les ganglions lymphatiques murins et faites-les macérer sur une passoire cellulaire. Rincer le tissu avec un milieu approprié pour obtenir une suspension unicellulaire.
Ajoutez du chlorure d’ammonium et de potassium, ou tampon ACK, pour lyser les globules rouges. Centrifugeuse pour séparer les cellules sanguines intactes du lysat. Jetez le surnageant et remettez les cellules en suspension dans un tampon approprié. Traitez la suspension avec un mélange d’anticorps anti-souris biotinylés pour cibler les cellules sanguines comme les granulocytes, les cellules B, les cellules NK et les érythrocytes restants. Les lymphocytes T ne sont pas ciblés et ne sont donc pas marqués.
Ensuite, ajoutez des microbilles magnétiques anti-biotine à la suspension. Toutes les cellules marquées à la biotine se lient aux microbilles. Lorsqu’elles sont maintenues sous l’influence d’un champ magnétique puissant, les cellules marquées magnétiquement adhèrent à la paroi du tube. Les lymphocytes T non marqués restent en suspension. Recueillez les lymphocytes T enrichis non liés dans un nouveau tube de prélèvement. Dans le protocole suivant, nous montrons l'isolement des lymphocytes T de la rate et des ganglions lymphatiques de souris, en utilisant une technique de séparation magnétique.
- Regroupez les ganglions lymphatiques et la rate dans une crépine de 40 micromètres et utilisez un piston de seringue pour faire macérer les tissus à travers les filtres afin de libérer les cellules. Lavez la passoire et le piston avec un milieu RPMI complété par 1 % de FBS pour collecter toutes les cellules et sédimenter les cellules par centrifugation. Ajoutez 5 millilitres de tampon de lyse ACK à la pastille cellulaire.
Après cinq minutes à température ambiante, arrêtez la réaction avec 5 millilitres de milieu complété par 1 % de FBS et granulez les globules blancs par centrifugation. Remettre la pastille en suspension dans 5 millilitres de tampon MACS pour le comptage et diluer les cellules à une concentration de 2 fois 10 à 8 cellules par microlitre dans un tampon MACS frais. Ajouter la concentration appropriée d’anticorps anti-érythroïdes, anti-granulocytes, anti-lymphocytes B et anti-déplétion des cellules NK par 1 fois 10 aux 6 cellules pour une incubation de 15 minutes à 4 degrés Celsius.
À la fin de l’incubation, lavez les cellules avec 10 millimètres de tampon MACS glacé et remettez le granulé en suspension à une concentration de 1 fois 10 à 8 cellules par millilitre dans un tampon MACS frais. Ensuite, ajoutez 0,22 microlitre de microbilles d’anti-biotine par 1 fois 10 aux 6 cellules avec mélange pour une incubation de 15 minutes à 4 degrés Celsius.
À la fin de l’incubation, laver les cellules avec 10 millilitres de tampon MACS glacé et recueillir les cellules T enrichies non liées par séparation magnétique des billes à l’aide d’un séparateur express MACS conformément aux protocoles standard d’isolement des billes. À la fin de la séparation, sédimenter les lymphocytes T par centrifugation et remettre la pastille en suspension dans 5 millilitres de tampon MACS frais pour le comptage.