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Recherche sur le cancer
0 vues • 5:21 min • April 30th, 2023
- Les cellules souches et progénitrices hématopoïétiques, ou HSPC, peuvent s’auto-renouveler et se différencier en divers types de cellules sanguines. Les HSPC accumulent progressivement des mutations de l’ADN au cours de la vie, ce qui peut contribuer à la leucémie. Pour analyser de telles mutations, les HSPC sont généralement générées à partir de la moelle osseuse.
Commencez par ajouter des anticorps conjugués aux fluorophores aux cellules mononucléées - des cellules souches adultes isolées de la moelle osseuse - et faites-les couver pendant la durée souhaitée. Les anticorps se lient à des marqueurs de surface cellulaires spécifiques tels que CD34. Maintenant, chargez le mélange dans la machine de cytométrie cellulaire activée par fluorescence ou FACS.
Les anticorps conjugués aux fluorophores deviennent fluorescents lorsqu’ils sont frappés par le laser. Des gouttelettes de cellules individuelles passent à travers le détecteur qui mesure l’intensité de la fluorescence, sur la base de laquelle la goutte possède une charge électrique. En présence de champs électromagnétiques, les cellules chargées positivement se déplacent vers le récipient négatif et vice versa.
Maintenant, cultivez les HSPC CD34-positifs triés par FACS dans un milieu approprié pendant la durée souhaitée jusqu’à ce que les clones soient visibles. Ensuite, délogez les clones par pipetage vigoureux et centrifugez pour granuler les cellules. Conservez la pastille contenant des HSPC clonaux à moins 20 degrés Celsius pour une analyse plus approfondie. Dans le protocole suivant, nous allons générer des clones HSPC à partir des cellules mononucléaires.
- Commencer cette procédure par la préparation de l’échantillon et la coloration comme décrit dans le protocole textuel. Ensuite, préparez 25 millilitres de milieu de culture de cellules souches et progénitrices hématopoïétiques, ou HSPC. Remplissez une plaque de culture cellulaire de 384 puits avec 75 microlitres de milieu de culture HSPC dans chaque puits. Pour éviter l’évaporation du milieu dans les puits extérieurs, remplissez les puits extérieurs avec 75 microlitres d’eau stérile ou de PBS et n’utilisez pas ces puits pour le tri cellulaire.
Le tri correct des HSPC de signaux viables est l’étape la plus critique de ce protocole. Réglez des vannes pour le tri HSPC sur la base d’un contrôle non coloré dans 10 000 cellules à partir de l’échantillon de coloration. Gate single cells en dessinant une porte autour de la hauteur de diffusion linéaire vers l’avant en fonction de la fraction de l’aire de diffusion vers l’avant.
Utilisez la fraction de contrôle non colorée pour dessiner une porte pour la fraction de lignage. Dessinez des portes pour les cellules CD34 positives, et caractérisez davantage ce sous-ensemble en définissant une porte spécifique pour les cellules CD38 négatives et CD45RA négatives. Chargez la plaque à 384 puits sur la machine FACS et triez les cellules individuelles. S’il s’applique à la machine FACS, activez l’option permettant de conserver les données de tri d’index pour permettre le suivi des cellules triées.
Pour cultiver des CSH triées individuellement, enveloppez la plaque de culture à 384 puits avec couvercle dans une pellicule de polyéthylène transparente. Transférez la plaque à 384 puits dans un incubateur humidifié à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone et conservez-la dans l’incubateur pendant trois à quatre semaines jusqu’à ce que des clones visibles apparaissent. Après quatre semaines de culture, déterminez quels puits ont une confluence de 30 % ou plus.
Pour chaque clone, préremplissez des microtubes de 1,5 millimètre avec 1 millilitre de BSA à 1 % dans du PBS et étiquetez le tube en fonction du puits correspondant. Prémouiller une pointe de pipette avec 1 % de BSA dans du PBS pour minimiser le nombre de cellules collant à la pointe de la pipette. Pipetez férocement le milieu de haut en bas au moins cinq fois tout en raclant le fond du puits avec une pipette de 200 microlitres réglée à 75 microlitres.
Recueillir la suspension cellulaire dans le microtube étiqueté qui correspond au puits. Répétez le pipetage dans le puits avec jusqu’à 75 microlitres de BSA et de PBS frais à 1 % pour assurer une absorption maximale des cellules. Les cellules cultivées clonées peuvent coller au fond d’un puits. Inspectez les puits à l’aide d’un microscope à lumière inversée standard pour vous assurer que toutes les cellules ont été collectées.
Si tous les puits dont la confluence est supérieure à 30 % ont été récoltés, remettez la plaque de 384 puits dans l’incubateur. Les cultures clonales peuvent proliférer jusqu’à cinq semaines. Faites tourner la suspension cellulaire pendant cinq minutes à 350 fois g. Une petite pastille doit être visible. Retirez soigneusement tout sauf environ cinq microlitres de surnageant. Les granules cellulaires peuvent être congelées à moins 20 degrés Celsius et stockées pendant plusieurs mois avant d’être isolées de l’ADN.